专栏名称: 药学进展
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独家原创|基质金属蛋白酶 2/9 响应型多肽探针的构建 及其应用研究进展

药学进展  · 公众号  · 药品  · 2021-05-19 11:57

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专家介绍：徐寒梅

中国药科大学教授（博士生导师），海洋药学专业负责人，国家药典委员会委员，江苏省合成多肽药物发现与评价工程研究中心主任，国家高层次人才计划入选者 , 联合国教科文组织 2020 年科学与技术大使；主持国家自然科学基金 , 国家“863”高科技发展计划 , 国家“十一五”、“十二五”、“十三五”新药创制科技重大专项多项；发表学术论文 142 篇（其中 SCI 收录 61 篇），包括发表在 JACS、CCR 及 Cell、Nature 子刊的文章等；申请国际国内专利 53 件。所获科技奖励：2019 年获得教育部技术发明奖一等奖，2018 年获得中国发明协会一等奖，2019 年获得中国产学研合作创新成果奖二等奖，2011 年度江苏省科技进步一等奖，2014 年江苏省医药科技奖一等奖，2019 年获得江苏医药科技进步奖二等奖

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基质金属蛋白酶 2/9 响应型多肽探针的构建及其应用研究进展

薛建鹏，刘少锋，汪瑾，杜南星，宋如铮，李瑜玲，张清昕，徐寒梅 *

（中国药科大学 江苏省合成多肽药物发现与评价工程研究中心，江苏 南京 210009）

[摘要] 基质金属蛋白酶家族是肿瘤侵袭转移过程中的一种重要酶类，已有研究表明激活的基质金属蛋白酶与肿瘤的侵袭行为之间明显相关。其中基质金属蛋白酶 2 和基质金属蛋白酶 9 在肿瘤侵袭中发挥了重要作用。通过构建探针对基质金属蛋白酶 2/9 进行检测，可以深入了解其性质及致病机理，并进一步了解肿瘤的恶化程度，从而进行及时治疗。通过对多肽探针检测基质金属蛋白酶 2/9 的原理和在疾病治疗方面的应用进行综述，为研究人员构建合适的探针检测基质金属蛋白酶提供参考。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteases，MMPs）是一类依赖于锌离子和钙离子的内源性蛋白水解酶，可由成纤维细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及肿瘤细胞合成和分泌。MMPs 可分为胶原酶、明胶酶、间质溶素类、膜型基质金属蛋白酶（membrane-type matrix metalloproteinase，MTMMPs）、基质溶解酶和其他 MMPs，主要参与组织重构和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解等重要生理过程 [1]。细胞外基质分布在细胞表面 或 细 胞 之 间， 由 基 底 膜（basement membrane，BM）和细胞间基质组成，具有阻止肿瘤细胞转移的作用。因此，细胞外基质的降解是肿瘤浸润和转移的早期步骤。

MMP-2 和 MMP-9 是最重要的 MMPs，在胰腺癌 [2-3]、乳腺癌 [4-5]、膀胱癌 [6-8]、宫颈癌 [9-10] 等多种肿瘤中都有异常表达，在肿瘤生理和病理进程中起着关键性的作用。肿瘤微环境中的 MMP-2 和MMP-9 高度特异性表达，可以降解肿瘤细胞表面的主要结构成分，使肿瘤细胞从缺失的 BM 向周围组织浸润，促进肿瘤细胞侵袭和转移 [11]（见图 1）。因此，通过构建检测 MMP-2/9 活性的探针并利用MMP-2/9 的底物特异性进行成像，可以实现对肿瘤恶性程度及转移风险的预估，从而进行及时治疗。因此，本文针对检测 MMP-2/9 的响应型多肽探针构建的机制及相关应用进行了综述。

1 常用基质金属蛋白酶的检测方法

目前，在对 MMPs 进行定性分析时，最常用的 检 测 方 法 是 明 胶 酶 谱 法（zymography）。明 胶酶谱法利用非还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电 泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）和反向凝胶染色来检测 MMPs 的活性，但该方法存在如 MMPs 的变性和复性步骤耗时长、孵育液含剧毒药物等缺陷。此外，体内组织中还存在组织金属蛋白酶抑制剂（tissueinhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP）， 其 能以共价键的形式与 MMPs 结合成复合体，特异性抑制 MMPs 的活性。TIMP 的存在对 MMPs 活性的检测结果产生干扰，因此明胶酶谱法仅适用于定性而非定量分析。

在对 MMPs 进行定量分析时， 最 常 用 的检 测 技 术是酶联免疫吸附技术（enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA）。ELISA 分析法利用抗原抗体专一性结合进行免疫反应，实现对 MMPs等蛋白酶的定性和定量检测，具有较高的检测灵敏度，可以实现对浓度水平较低的 MMPs 进行检测和定量计算。但是 ELISA 分析法需要多次孵育和清洗抗体，操作繁琐耗时，此外，对 MMPs 准确定量时还需要价格昂贵的特异性抗体，因此在肿瘤临床诊断和治疗监测中的应用也受到限制。

为了实现 MMPs 活性的简单、快速检测，基于比色法 [12-13] 和电化学测量法 [14] 的荧光检测法 [15-16]正在逐渐被开发。荧光检测法大多都是基于多肽检测探针的构建，该方法实验操作快速简便、数据全面、测定结果较为可靠。该方法可以实现对活细胞和组织内活性物质“定时、定量、定位、动态”的高灵敏度检测。

基于荧光检测法设计的多肽探针是一种广泛应用的蛋白酶检测手段，作为生物探针，其具有相对分子质量小、稳定性高、响应穿透能力强等优点，能与待测蛋白酶作用并产生荧光作为检测的信号，因而可以用于响应蛋白的分子成像，提供精确和专一的疾病诊断信息，在复杂生物样品的分离分析领域表现出广阔的应用前景。

2 基质金属蛋白酶的响应型多肽探针检测法

近年来，基于 MMPs 活性的多肽探针已被广泛报道，为检测肿瘤恶性程度和转移情况提供了一种简便、灵敏的实时检测方法。按照探针构建原理可以将其分为：1）基于荧光共振能量转移（fluorescenceresonance energy transfer，FRET） 的 多 肽 探 针；2）基于生物发光共振能量转移（bioluminescenceresonance energy transfer，BRET）的多肽探针。

2.1 检测 MMP-2/9 的响应型 FRET 多肽探针构建机理

FRET 是一种重要的光物理技术，常用于检测2 个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。在 FRET系统中，距离较近的 2 个基团中能量供体分子将能量转移给能量受体分子，产生了一种能量转移现象。近年来 FRET 在生物医学中应用广泛，其在研究生物大分子的结构功能及相互作用、细胞器功能和活细胞信号通路等方面均有应用。利用 FRET 原理的MMP-2/9 的响应型多肽荧光探针已被大量的开发，适用于对体内细胞和组织的 MMP-2/9 实时检测。这些探针的结构主要由 MMP-2/9 活性底物肽链、FRET 系统能量供体、FRET 系统能量受体和其他附加基团组成（见图 2）。

目前已构建成功的检测 MMP-2 的响应型荧光多肽探针中，MMP-2 的主要识别位点为 GV 和 GL（见表 1），最常见的特异性底物片段是 PLGVR。MMP-9 的识别位点较多，其底物片段如表 2 所示。

2.2 检测 MMP-2/9 的响应型 FRET 多肽探针作用机制

MMP-2/9 活性荧光成像探针在初始时形成FRET 系统，能量受体-多肽-能量供体所构成的多肽检测探针结构完整，能量受体猝灭能量供体的荧光，探针为荧光猝灭状态，故无荧光产生，FRET系统建立。当 MMP-2/9 催化探针的活性肽水解时，FRET 系统遭到破坏（多肽链断开），故能量受体不能猝灭能量供体的荧光，能量供体发射较强荧光，因此可通过荧光强度实时反映酶的活性和酶在组织与细胞间的表达情况。构建酶活性荧光成像探针检测 MMP-2/9 的活性具体机制如图 3 所示。

2.3 MMPs 的响应型 FRET 多肽探针的应用

2.3.1 MMPs 的响应型 FRET 多肽探针在肿瘤诊断中的应用 根据 MMPs 在肿瘤微环境中的特性，研究人员利用其响应多肽探针对肿瘤进行检测，并得到了良好的反馈。Oriana 等 [37] 利用 FRET 原理，设计并合成了用于检测 MMP-2 活性的多肽探针。在较温和的条件下，通过 Michael 加成反应和 KAHA连 接 反 应， 将 MMP-2 底物片段 Gly-Pro-Leu-GlyVal-Arg-Gly、FRET 能量供体甲氧基香豆素乙酸（methoxycoumarin acetic acid，MCA）、FRET 能量 受 体 二 硝 基 苯 胺（dinitrophenylamine，DNP）与 聚 乙 二 醇（polyethylene glycol， PEG）连接成MMP-2 活性多肽探针。他们用该探针与随机多肽序列合成的阴性对照探针分别进行了体外荧光光谱分析。结果显示，在 pH = 7.5 的 Tris 缓冲液中，完整的 MMP-2 活性的多肽探针和阴性对照探针均呈现低荧光发射；分别加入 MMP-2 后，观察到 MMP-2活性响应的多肽探针的荧光发射显著增加，而阴性对照探针仍只显示微弱的荧光，证明该探针可以应用体外 MMP-2 的检测。

利用 FRET 原理设计合成的多肽探针应用于蛋白酶的检测已有很多报道，而多功能、多靶点的多肽荧光探针也正被逐渐开发。Cheng 等 [38] 设计并验证了一种新颖的单分子多肽荧光探针，可以对人纤维肉瘤细胞 HT1080 和鳞癌细胞 SCC-7的 MMP-2 和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 -3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）进行同时、实时成像。该探针的活性多肽片段特异性较强，其对 MMP-2 和 Caspase-3的成像选择性较好。此外，该多肽荧光探针涉及 2个 FRET 过程，因此对 MMP-2 的成像和 Caspase-3的成像过程相互独立，满足了对癌症进行精确诊断和治疗的要求。

2.3.2 MMPs 的响应型 FRET 多肽探针在关节炎诊断中的应用 MMPs 能够降解软骨细胞赖以生存的细胞外基质，使其合成与降解失衡，导致软骨退变和关节炎的发生和发展。Lee 等 [39] 及 Sun 等 [40] 设计了另一个 MMP-13 的活性多肽探针。MMP-13 底物序列为 Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- GlyLys。这个探针经过 Cy5.5 和 BHQ-3（black holequencher-3）标记后，在体外的对 MMP-13 检测实验中，荧光值增加了近 30 倍。在抑制实验中，加入MMP-13 的抑制剂后，再与多肽探针孵育，未发现明显的荧光值增加。在体内实验中，注射 MMP-13的活性多肽探针到关节炎模型大鼠中，利用光学成像系统成像，发现在关节炎部位有明显的荧光信号，而在大鼠其他健康部位未有明显荧光信号。

2.4 MMPs 的响应型 FRET 多肽探针的优化

2.4.1 提高多肽探针的稳定性 稳定的探针结构是有效递送探针、增加成像分辨率的先决条件。Chen等 [41] 提出了一种检测体内和体外 MMPs 表达水平的方法，即建立甲氧基聚乙二醇-纳米金-MMPs 活性多肽片段-异硫氰酸荧光素（mPEG-GNP-PeptideFITC）探针， 直接、准确地反映 MMP-2、MMP-4和 MMP-9 的活性及其在体内的分布状况。该探针的设计基于 FRET 原理，以纳米金粒子为能量受体猝灭能量供体 FITC。纳米金粒子具有形状尺寸可控、表面修饰能力强、物理化学性质可调节等优点，因此成为生物传感器研究的热点。此外， mPEG 也结合到纳米金的表面，稳定探针结构，减少探针被非特异性酶破坏并避免免疫细胞的清除，最后以探针形式在体内延长循环时间。实验结果显示纳米金能增强 HepG2 肝癌细胞对探针的吸收能力，提高探针在 Heps 荷瘤小鼠的组织渗透性。此外，该纳米金探针在正常组织中的分布较低，在肝组织有较高的分布。这种新型的纳米金-多肽探针有望应用于活体肝癌的特异性成像，为肝癌的筛查、早期诊断和预后判断提供一种无创的成像手段。

2.4.2 提高肿瘤检测的灵敏度 尽管肿瘤检测方法在不断改进，但临床血液分析、医学影像技术仍难以检测出直径小于 1 cm 的肿块和肿瘤脱落的生物标记物。Kwong 等 [42] 合成了利用无创操作检测尿液中 MMPs 活性的纳米多肽探针。静脉注射给药后，这种检测探针首先响应聚集在肿瘤发生部位并被MMPs裂解，裂解后的探针碎片过滤到尿液中。最后，对尿液进行紫外-可见分光光度法分析和质谱分析。在此基础上，Kwon 等 [43] 合成了高灵敏度、强穿透力的检测肿瘤患者尿液中 MMP-9 活性的多肽探针。为了验证该探针对人体肿瘤样本的响应，研究人员将 MMP-9 活性多肽探针法所能检出的肿瘤的体积和血液生物标志物 HE4 检测法所能检出的肿瘤的体积进行对比，结果显示该探针更加灵敏，能检测出体积更小的肿瘤。在检测时间上相比，MMP-9 活性多肽探针比 HE4 检测法提前 5 个月检测出原位肿瘤。该探针显著提高了对 MMP-9 的特异性，减少了探针脱靶的几率并增强了探针在肿瘤组织的穿透力，有望实现肿瘤的早期诊断并改善患者的预后。

2.4.3 引入生物相容性材料 Lee 等 [39] 将 FRET 系统的能量供体分子罗丹明 B 包裹在 PLGA-PEI 纳米粒中，并在纳米粒表面修饰多肽探针。用阳离子改性剂聚醚酰亚胺（polyetherimide，PEI）和生物相容性材料聚乙丙交酯（poly lactide-coglycolide， PLGA）制成的纳米粒明显增强了探针的细胞渗透性，且无细胞毒性反应。通常情况下，纳米成像探针可在被动的渗透和滞留效应（permeability and retentioneffect，EPR）下响应并积聚在肿瘤组织。目前开发的许多 MMPs 的响应型多肽探针，其检测范围也大多仅限于肿瘤细胞外部及周围区域，容易被血液中的蛋白酶迅速清除，探针难以进入细胞内部产生稳定的检测信号。细胞穿膜肽（cell-penetratingpeptides，CPPs）的引入可以增加探针的细胞渗透性，实现胞内酶活的实时测定。Sun 等 [40] 将 MMP-2 多肽底物片段与 CPPs 连接起来，设计了可以穿透肿瘤细胞膜屏障的探针，该探针可实时反映特定肿瘤细胞内 MMP-2 的活性。

2.4.4 克服肿瘤组织其他代谢物质的干扰 肿瘤微环境中一些生化物质如硫醇类的积累对 MMPs 的检测也带来了一定干扰。Gao等[20]发现巯基化合物（谷胱甘肽）和 MMPs 均可以与纳米金形成金-硫键，竞争结合纳米金修饰的多肽探针，造成检测信号失真，出现假阳性的肿瘤诊断结果。为了克服这个问题，他们将纳米金替换为纳米金-硒设计出了新的多肽探针。硒能迅速打破金-硫键，与金形成更稳定的金 - 硒键。在模拟生理条件下，纳米金-硒修饰的多肽探针不仅具有很高的热稳定性，并且在测定 MMP-2 活性时呈现出较强的抗谷胱甘肽干扰的能力。

2.5 检测 MMPs 的响应型 BRET 多肽探针构建机制及应用

与 FRET 系统的构建机理相似，BRET 探针的构建由 MMPs 活性肽链连接生物发光供体和荧光蛋白受体。BRET 探针在测定酶活性的过程中无需背景的消除，相比 FRET 具有较低的背景干扰和检测灵敏度。

Wang 等 [44] 设计了一种检测 MMP-13 的 BRET探针，以海肾的荧光素酶突变体（Rluc8）为生物发光供体，以黄色荧光蛋白为受体，供体和受体可通过 MMP-13 特异性识别的多肽底物片段连接。当MMP-13 特异性识别降解多肽链，使 BRET 系统被破坏并产生荧光信号变化，根据荧光信号变化情况可以计算出 MMP-13 的活性和表达水平。

得益于 BRET 方法在不破坏细胞的情况下可以监测蛋白相互作用（protein-protein interactions，PPI）的特性，BRET 方法已作为研究活细胞中分子相互作用的通用技术之一。BRET 分析已用于研究许多跨膜型受体，包括 G 蛋白偶联受体 [45]。

近年来，通过将该分析方法与多种检测设备（例如发光板读取器、生物发光显微镜和小型动物光学成像平台）联用，大大提高了 BRET 的适用性。

3 结语和展望

与核酸和蛋白质相比，基于多肽的检测探针化学合成简便、容易标记。随着新型荧光剂、新型多肽片段和新型材料的发现与发展，必将产生更多新型多肽探针，对蛋白质的体内体外检测将起到很大的推动作用。已有研究设计、筛选、合成、优化了多种 MMP-2/9 的响应型多肽探针，在肿瘤内 MMPs检测以及肿瘤的早期诊断当中取得了初步成功，具有普遍性和实用性，可以作为其他蛋白酶类多肽探针的开发平台的参考。然而 MMP-2/9 的响应型多肽探针的开发仍面临着诸多挑战，如 MMP-2/9 的特异性多肽片段难发现、肿瘤微环境中 MMP-2/9 与探针结合不稳定等。此外，MMP-2/9 响应型多肽探针的设计和制作成本仍较高，以及探针的回收和固定化也需在其应用于临床检测之前解决。鉴于 MMP-2/9的响应型多肽探针在疾病检测方面的广阔应用前景，设计和开发响应性强、生物兼容性好的生物成像和检测探针对肿瘤及其他疾病的预防、诊断和治疗意义重大。

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