2024/5/7发表在《nature communications》（IF：14.7）杂志，题目为“纵向分子分析阐明了乳腺癌的免疫代谢动力学Longitudinal molecular profiling elucidates immunometabolism dynamics in breast cancer”。此项研究收集150例接受新辅助化疗(NAC)的HER阴性患者队列，在GEP、WES、snRNA、mfIHC和proteome等层次进行相关检测。基于多组学数据对HER阴性患者免疫代谢表型和预后相关性的分析，从而在NAC对肿瘤免疫代谢中进行深入探究。
整合多方位数据，让治疗进展具象化
基于多组学分析，动态揭示肿瘤-TME-代谢相互作用在这项文章中，作者使用基于质谱的蛋白质组学、批量RNA微阵列、单核RNA测序（snRNA-seq）、血液-肿瘤配对全外显子组测序（WES）、组织病理学和体外验证，纵向全面表征HER2阴性乳腺癌的基因组和蛋白质组学景观。
主要研究了（1）评估免疫和代谢分子表型的相互作用和预后相关性，（2）量化NAC期间免疫代谢相互作用如何演变，（3）揭示与NAC反应相关的免疫代谢生物标志物和细胞表型，（4）在单细胞分辨率中通过免疫状态描绘代谢异质性，以及（5）探索克隆进化对塑造TME开关的影响。
医学术语补给站：
文章中涉及到的肿瘤的"热"、"温"、"冷"通常是指肿瘤的代谢活跃程度和血管生成情况，这些术语在医学领域尤其是肿瘤学中用来描述肿瘤的生物学特性和它们对免疫治疗的响应情况。
热肿瘤(Hot Tumor)：通常指的是那些具有高度免疫原性的肿瘤，它们能够激活免疫系统，产生大量的免疫细胞浸润，并且可能对免疫治疗有较好的反应。这些肿瘤的血管生成活跃，代谢率高。
温肿瘤(Warm Tumor)：这类肿瘤的免疫原性介于热肿瘤和冷肿瘤之间。它们可能有一定的免疫细胞浸润，但不像热肿瘤对免疫治疗的反应那么强烈。
冷肿瘤(Cold Tumor)：指的是那些免疫原性较低，免疫细胞浸润较少的肿瘤。这些肿瘤通常对免疫治疗的反应较差，因为它们缺乏足够的免疫细胞来识别和攻击癌细胞。
一、研究背景
尽管对乳腺癌中肿瘤细胞和肿瘤微环境（TME）内的代谢重编程已有详细描述，但对治疗过程中免疫状态和癌症代谢之间的相互作用却知之甚少。瑞典卡罗林斯卡学院的研究人员利用蛋白质组学、基因组学和组织病理学，对从乳腺癌患者新辅助化疗（NAC）前、中、后纵向收集的肿瘤组织样本的免疫代谢谱进行了表征。研究表明，免疫状态、肿瘤代谢蛋白和基于肿瘤细胞基因表达谱的代谢表型在治疗前、中、后的动态变化与治疗反应相关。单细胞/细胞核 RNA 测序揭示了冷肿瘤和热肿瘤之间不同的肿瘤和免疫细胞代谢状态。基于上述分析的 NAC 潜在驱动因素在体外得到了验证。该研究表明，肿瘤内在代谢状态与 TME 的相互作用与治疗结果相关，支持了以肿瘤代谢为靶点进行免疫调节的概念。
二、文章主要内容及结果：
1.乳腺癌队列纵向蛋白基因组分析
作者通过PROMIX试验收集了纵向组织活检(预处理和两个周期后)和手术标本，建立了150例HER2阴性乳腺癌患者的多组学队列，其中包括整体微阵列基因表达谱(GEP)、单核RNA-seq (snRNA-seq)、全外显子组测序(WES)、多重荧光免疫组化(IHC)和基于MS的蛋白质组学等层次的相关检测。（图1）
图1.研究设计概述和多组学数据收集2.免疫景观及其预后意义
运用基因组和蛋白质组学分析揭示并验证了不同的免疫簇并发现免疫热肿瘤与更好的治疗反应相关。
为了更好地描述在新辅助化疗（NAC）期间的肿瘤微环境的变化情况，作者分析了三个时间点(NAC前/中/后)的GEP数据，并使用mf IHC和蛋白质组学层面上进行分析验证。如图a使用GEP数据和quanTIseq的免疫细胞组分进行整合评分，对无监督的免疫状态进行类聚建模，将样本分类为三种不同的免疫状态：冷(n = 100)，暖(n = 118)和热(n = 57)(图2a)。图2b则显示了TILs、采样时间点和免疫状态之间的细胞分布。总体而言，热肿瘤体现出比温肿瘤和冷肿瘤更强的中密度TIL浸润和高密度 TIL浸润，肿瘤细胞与时间点在三种免疫状态之间的分布没有差异(图2b)。此外，基于quantiseq的免疫细胞组成表明，热肿瘤中CD8 + T细胞、B细胞和M1巨噬细胞等活化细胞的比例最高。相反，M2巨噬细胞等抑制细胞较低。
作者利用多重荧光免疫组织化学(mfIHC)来支持上述免疫细胞反卷积结果，并使用二值化标记(co)表达模式来分配细胞类别。mfIHC结果显示，热肿瘤的B细胞密度、CD8 + T细胞密度高于冷肿瘤，而巨噬细胞M2细胞密度则低于冷肿瘤(图2c)。图2d则运用蛋白质组学数据进行了不同免疫亚型之间的蛋白质水平差异分析，结果显示相较于冷肿瘤，热肿瘤和温肿瘤中免疫激活生物标志物(如GZMK、CD8A、HLA-A、CD48)的水平上调。然后通过DFS（无病生存率）、pCR（病理完全缓解）的多变量 Cox 和 Logistic 回归分析的森林图确定肿瘤免疫状态与预后的相关关联(图2e)。
图2：免疫状态与临床结果的关系3.肿瘤代谢表型与免疫状态相互作用
作者发现基于肿瘤细胞基因表达谱数据（GEP）的代谢表型和免疫状态亚型之间的关键相互作用，并强调了细胞代谢的预后作用。
以无肿瘤细胞的样本的GEP为对照，提取肿瘤细胞基因表达谱，然后根据各特定代谢途径(脂、氨基酸、TCA、能量、碳水化物、核酸和维生素)的基因集进行GSEA预排序分析分为三种代谢状态(上调，中性和下调)，（图3a）进一步在基因和蛋白水平上验证肿瘤细胞基于GEP的代谢表型。图3b显示了所有患者和每个乳腺癌亚型的免疫状态中整体/肿瘤细胞衍生的代谢状态的比例。上调血脂、氨基酸、TCA循环和维生素/辅因子代谢途径与免疫学热点肿瘤呈负相关(图3b，c)。进一步评估了七种不同代谢途径(基于肿瘤细胞/整体GEP)和免疫状态的成对相关性(图3d)。
图3：肿瘤细胞基于GEP的代谢状态与免疫状态的相互作用4. 免疫代谢表型和通路蛋白质组学图景
利用53例肿瘤样本进行蛋白质组学分析，鉴定到10,946种蛋白质，并进一步对42例样本的mRNA和蛋白质组数据做相关性分析，结果显示55%蛋白质呈正相关(图4a)，此外，在Biogrid或CORUM数据库进行互作蛋白的相关性分析，显示在mRNA-mRNA和蛋白质-蛋白质相关性之间存在差异。与mRNA水平相比，蛋白质水平的正相关性更高，表明相关生物过程在蛋白质水平上受到严格调控。与代谢和免疫功能相关的蛋白质显示出与其对应转录本丰度的不同相关性(图4b,c)。在排除弱相关性(绝对Pearson’s r < 0.3)的蛋白质对后，使用免疫代谢和乳腺癌特异性(PAM50)蛋白绘制了蛋白相关网络。结果表明，具有相似生物学功能的蛋白质是高度连接的。同时显示，脂质蛋白在免疫相关模块中富集(图4d)，支持了脂质代谢在免疫功能(如抗原呈递和T细胞激活)中的重要性。三种免疫状态下免疫代谢蛋白的平均丰度存在差异，这强调了TME在塑造肿瘤代谢景观中的作用。与冷肿瘤相比，热/温肿瘤在氨基酸和核苷酸代谢方面可能具有更高的平均蛋白质丰度(图4e)，这可能是由于功能性免疫细胞对营养的额外需求。图4f总结了热肿瘤和冷肿瘤在主要代谢途径上差异表达的mRNA和蛋白质的图谱，以寻找FDA批准的潜在药物靶点(灰色突出部分)，并且发现这些药物与TME在阻止肿瘤生长方面有协同作用。
图4：基于MS的免疫代谢表型和途径的蛋白质组学景观5.免疫代谢的纵向成对分析
通过分析69例患者在接受NAC（新辅助化疗）治疗前/中的免疫与代谢变化，两个治疗周期后，约40%的冷肿瘤成功转化为温或热肿瘤（图5a，图5b）。图5c则显示了69个配对治疗前/治疗中样本的免疫特征，如果肿瘤在NAC后保持冷免疫状态或转向冷免疫状态，则定义为免疫状态的阴性变化，反之亦然。图5d森林图描绘了多变量 logistic 回归模型，该模型调整了肿瘤大小、淋巴结状态和 IHC 亚型，评估了免疫代谢谱与病理完全缓解（pCR）之间的关联。结果显示，免疫状态改变阳性的患者在调整肿瘤大小、淋巴结状态和乳腺癌亚型后更有可能实现pCR(图5d)。此外，评估了整合免疫代谢谱(图5e所示的第1-4组)和NAC治疗后反应组和无反应组。发现与其他组相比，免疫状态和代谢表型均为阳性的患者更有可能对NAC产生反应(图5e)。为了确定NAC期间免疫代谢中的潜在肿瘤驱动因素和生物标志物，根据客观缓解（ORR）状态(部分缓解与稳定疾病或疾病进展)分别进行了纵向差异mRNA和蛋白质表达分析(图5f，g)。结果显示几种免疫相关蛋白，包括IL32、CCL18、CD247和CD8A，与NAC反应呈强正相关。相反，TCA循环和核苷酸代谢中的蛋白质被下调(图5f)。在“无反应”组中，仅在蛋白质水平上确定了上调的碳水化合物(SLC6A8、HS6ST2、SLC5A1)和CD8 + T细胞(CD244)生物标志物(图5g)。这些发现为理解治疗抵抗机制提供了新的视角。
图5:成对的治疗前/治疗中样本的蛋白质组学分析揭示了免疫代谢变化和对NAC的反应之间的关联
6.TME中代谢状态和重编程的单细胞转录分析
为了在单细胞分辨率下更好地表征TME的代谢异质性和细胞组成。在PROMIX试验中(样本n = 16，细胞n = 3039)，利用7种代谢途径基因集的单核RNA-seq鉴定乳腺癌治疗前/中/后乳腺上皮细胞的5个代谢簇(MC1-5)(图6a、b)。 按免疫状态变化进行划分的每个采样时间点中代谢上皮细胞簇的百分比。发现代谢特异性上皮簇的组成在预处理和治疗前/中/后的样本中发生了变化，这与免疫状态变化(阴性或阳性)显著相关（图6c）,然后将（a）中前10个差异表达基因与所有其他簇的热图比较，并且根据代谢特征评分分析和量化每个乳腺上皮细胞簇 （MC）的代谢特征。结果分析发现上皮MC1(pdk 4、DCN、ACTA2、FABP4)的特征在于正常的上皮细胞、抗原呈递(趋化因子)和甘油脂类代谢，并且在免疫状态改变阳性的组中，MC1比例在NAC后增加。在MC2(fabp 5、MTHFD2、TPI1、GAPDH)中，发现了一个高度增殖(嘌呤、叶酸一碳代谢)的上皮细胞亚群，具有活跃的生物能代谢特征(即氧化磷、糖酵解)(图6d，e)
此外，轨迹分析强烈支持MC2通过其他代谢群的转换(图6f)。伪时间排序证明了从正常乳腺上皮细胞(MC1)到恶性低氧和糖酵解表型(MC2)的有序、渐进、逐步转变(图6f)。免疫状态改变组在治疗前/中/后乳腺上皮细胞的差异表达基因分析，以确定免疫代谢中的差异表达模式(图6g，h)。在阴性变化组中，NAC后下调的基因与抗原呈递/主要组织相容性复合体(MHC)(HLA-DRA、HLA-DPAI、HLA-B、HLA-C、HLA-dq B1、CXCL9/10/11)相关，代谢基因上调(RPL5、GAPDH、TPI1、DCXR、ATP5G2)，而阳性变化组的患者则相反(图6g，h)。此外，计算了上皮细胞的癌症抗原呈递和代谢的GSVA评分，证明治疗期间乳腺上皮细胞的动态代谢变化与免疫状态转换相关(图6i)。
图6：利用纵向单核RNA-seq鉴定免疫状态进化过程中的代谢重编程7.免疫细胞和基质细胞的代谢异质性分析
通过运用乳腺癌单细胞数据集的HER2阴性数据(图7a)，分析免疫细胞和基质细胞的代谢特征。研究发现乳腺上皮细胞、免疫细胞或基质细胞主要依赖于氧化磷酸化，但TME中同样存在多种代谢和变异（图7b，c）。与此同时，糖酵解在免疫效应细胞中也有富集，包括记忆B细胞、CD8 + T细胞、循环T细胞、单核细胞和循环髓细胞。作为肿瘤基质和ECM的主要成分，肿瘤相关成纤维细胞(CAF)和内皮细胞显示出代谢可塑性并具有相似的代谢活性(氧化磷酸化、糖酵解、谷胱甘肽和细胞色素P450)。以CD8 + T细胞的平均比例作为截断值，将21例肿瘤进一步分为免疫冷肿瘤(n = 13)和免疫热肿瘤(n = 8)两类。然后，使用每个样本的免疫细胞和基质细胞的伪体积基因谱计算了代表代谢途径的GSVA评分，并在热肿瘤和冷肿瘤之间进行了比较(图7d)。研究显示热肿瘤的免疫效应细胞比冷肿瘤的免疫效应细胞具有更高的代谢活性，包括丙酮酸(CD4 + T细胞和NK细胞)、糖酵解(NK细胞)、柠檬酸循环(CD8 + T细胞和NK细胞)和脂肪酸代谢(CD4 + /CD8 + T细胞)，而CD4 + T细胞氨基酸(谷胱甘肽)代谢信号在冷肿瘤患者中比热肿瘤的高，此外循环T细胞和记忆B细胞具有相似趋势(图7d)。
图7：免疫细胞和基质细胞的代谢异质性8.TME相关代谢靶点的体外验证
通过综合分析乳腺癌HER2阴性患者的bulk GEP、蛋白质组和snRNA-seq数据，证明相关代谢基因（FASN、ALDOA、HMGCS1和ACACA）在冷肿瘤中表达上调；在具有阴性免疫状态变化治疗中/后肿瘤中存在RLP5、GAPDH、TPI1、DCXR基因。根据这些分析结果，进行一系列体外验证实验，通过敲除相关代谢基因进行细胞活性，凋亡等表型实验验证分析结果（如图8）。综上所述，体外数据支持了靶向代谢基因可能导致免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤和肿瘤生长抑制的假设，从而为该领域的未来研究提供见解。
图8：TME相关代谢靶点的体外验证9.新辅助化疗下肿瘤克隆性和免疫状态亚型的共同进化
为了深入了解肿瘤细胞和免疫状态如何在TME下共同进化，作者在PROMIX试验中对来自20名TNBC患者的纵向肿瘤样本的WES数据进行了克隆分析。研究发现热/温肿瘤患者在接受治疗前后比冷肿瘤患者更具有异质性(图9a)，并且发现免疫状态变化与治疗中的克隆进化相关(图9b)。
在免疫状态改变阴性和阳性的患者中，相对于其亲本具有显着生长优势的亚克隆示例，这些亚克隆包含已知的代谢驱动因素。集中对20名NAC治疗的三阴性乳腺癌（TNBC）患者亚克隆进行分析(图9c，d)。其中两位患者(152和310)的亚克隆含有已知的代谢驱动因子，并且其生长显著高于亲代克隆，表明两个患者都具有阴性免疫表型变化和克隆持久性(图9c)。在患者206中进一步观察到强烈的生长加速，患者206具有阳性免疫状态改变和克隆性灭绝，具有与化疗抗性相关的介体复合物亚单位12 (MED12)突变。相反，那些具有已知乳腺癌驱动因子的亚克隆(患者155、115和612，图9d)与其亲代克隆相比没有显示出生长率优势。
图9：新辅助化疗下肿瘤克隆性和免疫状态亚型的共同进化三、讨论：
在肿瘤微环境（TME）中，肿瘤与免疫细胞的代谢重编程越来越被认为是促成这些细胞之间复杂作用的关键途径。该研究不仅验证了新辅助化疗（NAC）治疗期间对乳腺癌进行纵向活检的蛋白质基因组学分析的可行性，还系统性地鉴定了治疗过程中的无偏倚生物标志物及细胞表型变化。这些发现显著加深了我们对肿瘤-TME-代谢相互作用动态特性的理解，同时揭示了预后免疫代谢生物标志物及潜在的免疫调节候选物作为未来治疗策略的新靶点。未来则聚焦于通过机制实验和临床试验，深入探究这些免疫代谢靶点的具体作用机制及其治疗方案的疗效评估，以期为精准医疗提供更为坚实的科学依据。
