单细胞揭示与铁死亡相关的生物标志物，构建肝细胞癌预后模型

方法

结果

目的： 通过单细胞分析揭示HCC样本中单细胞层面的特征，并识别与铁死亡相关的细胞亚群。

结果：

1. 从GSE140228中获得了总共31869个细胞，癌症和对照组之间的细胞分布相对均匀，表明样本间无明显批次效应（图1A，B）；

2. 使用细胞特异性生物标志物共识别出六个细胞亚群，包括T细胞、髓系细胞、NK细胞、浆细胞、B细胞和肝细胞，其中一个亚群无法明确区分，标记为未知（图1C）；

3. 柱状图展示了各组中不同细胞类型的比例（图1D）；

4. 通过点图可视化了每种细胞类型的特定基因表达（图1E）。

目的： 识别和分析在单细胞水平上活跃的铁死亡细胞亚群，并探究这些亚群的发育轨迹。

结果：

1. 共识别出585个显示铁死亡活性的细胞（AUC值>0.2），其中髓系细胞亚群显示出最高的铁死亡活性（图2A-C）；

2. 髓系细胞的伪时序分析揭示了不同状态之间的显著变化，其中Cellfate1（状态4）显示出相对稳定的铁死亡活性，而Cellfate2（状态5）铁死亡活性显著降低（图2D-F）；

3. 对分支点前后的细胞进行了差异基因表达分析，并在不同的细胞分支中发现了不同的基因富集通路（图2G）。

目的： 了解肝细胞癌（HCC）肿瘤免疫微环境（TIME）中的相互作用。

结果：

1. 与正常组织相比，HCC微环境中细胞间相互作用的总数增加，但这些相互作用的强度降低（图3A）；

2. T细胞到髓样细胞的信号数量和强度增加（图3B）；

3. 在HCC中，针对髓系细胞的GALECTIN信号强度减弱，而源自髓系细胞的MHC-I信号在此背景下增强（图3C）；

4. 在HCC中，来自T细胞的巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）配体与髓样细胞上的相应受体之间的相互作用增加，而来自肝细胞的淀粉样前体蛋白（APP）配体与髓样细胞上的相应受体之间的相互作用减少（图3D）；

5. 进一步分析发现，APP信号通路由肝细胞发出并由骨髓细胞接收，而MIF信号通路由肝细胞、浆细胞、NK细胞和T细胞发出并由骨髓细胞接收（图3E，F）。

目的： 探究DEGs在生物学功能和途径中的作用，以及它们与HCC的相关性。

结果：

1. 在髓系细胞中共识别出1943个DEGs，并用热图展示TOP20DEGs表达情况（图4A）；

2. 将HCC样本与GSE140228数据集正常样本进行比较，识别出336个DEGs（图4B）；

3. 铁死亡激活的髓系细胞和HCC样本之间的DEGs交集共有273个基因（图4C）；

4. GO分析显示这些基因富集在白细胞介导的免疫过程和T细胞激活等生物学过程中（图4D）；

5. 分子功能分析显示富集在MHC蛋白复合体结合、MHC类II蛋白复合体结合和免疫受体活性等方面（图4D，E）。

目的： 识别与HCC预后相关的关键基因，并建立一个预测模型来评估HCC患者的生存风险。

结果：

1. 通过对之前的273个基因进行单因素Cox分析初筛出36个与HCC预后显著相关的基因；

2. 将HCC样本按3：7比例随机分成训练集和验证集，并在训练集中用LASSO回归分析进一步筛选出10个与HCC患者预后密切相关的基因（图5A，B）；

3. 基于这10个基因构建的风险评分模型，并根据患者风险评分中位值划分高风险和低风险组；

4. 热图展示了训练集和验证集中10个选定的铁死亡活性基因的表达模式（图5D，G）；

5. 在训练集和验证集中，高风险患者群体显示出显著较差的总体生存率（图5C，F）；

6. scFRGs模型在训练集和验证集中均展现出良好的预测性能，AUC值在1年、3年、5年生存预测中均较高（图5E，H）；

7. scFRGs风险模型在Cox回归分析中显示出与HCC患者预后的独立关联（图6A，B）；

8. 根据多因素Cox回归结果建立了预测列线图，ROC曲线和校准曲线显示其具有良好的预测准确性（图6C-E）。

目的： 分析不同风险组的通路模式，这可能与HCC的进展和治疗响应有关。

结果：

1. 基于MsigDB数据库通路信息对不同风险组间DEGs进行GSEA分析，发现它们富集于剪接体、DNA复制、细胞周期、白细胞跨内皮迁移、阿尔茨海默病和初级胆汁酸生物合成途径（图7A-F）；

2. 热图展示了不同风险组间差异最显著的5条通路的通路活性（图7G）。

目的： 揭示不同风险组之间免疫微环境的差异，并评估这些差异对免疫治疗反应的潜在影响。

结果：

1. 应用ssGSEA方法进行肿瘤免疫浸润分析，发现高风险和低风险组间多种免疫细胞浸润水平存在显著差异，包括激活的B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞等（图8A）；

2. 大多数免疫细胞类型彼此之间表现出正相关，而少数免疫细胞类型表现出负相关（图8B）；

3. scFRGs中的特定基因与某些免疫细胞类型显示出显著的相关性，例如ANXA5与调节性T细胞的相关性，CXCR3与多种免疫细胞的相关性；

4. 箱线图显示，低风险组的TIDE分数较低，表明可能对ICIs治疗有更好的反应，而高风险组的T细胞排除和功能障碍分数较高，可能对ICIs治疗的反应较差（图8C）；

5. 大多数对ICI有反应的病例都出现在低风险组中（图8D）；

6. 此外，基于免疫细胞浸润评分的时间依赖ROC曲线，分析显示，scFRGs模型的预测效率优于基于单个免疫细胞类型的模型。

目的： 评估HCC患者中基于scFRGs风险评分的TMB差异以及对化疗药物的潜在敏感性。

结果：

1. 尽管在基于scFRGs风险评分的高风险和低风险组之间没有观察到TMB的显著差异，但TP53和CTNNB1是两个组中突变频率最高的基因，TMB仍可能作为预测免疫治疗反应的潜在标记物（图9A-C）；

2. 药物敏感性预测分析结果显示，高风险评分的患者可能对Bortezomib、Daporinad、Dinaciclib、Docetaxel等化疗药物有更高的响应可能性，而低风险评分的患者可能从免疫检查点抑制剂治疗中获益更多（图9D-L）。