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简单生信结合少量实验3+分模板

科研菌 · 公众号 · · 2020-12-06 22:06

正文

今天给大家带来的是2020年3月发表在Annals of Translational Medicine（IF=3.297）杂志上的文章“Identification of key candidate genes and pathways revealing the protective effect of liraglutide on diabetic cardiac muscle by integrated bioinformatics analysis”。这篇文章通过简单的生信分析对经利拉鲁肽治疗的小鼠心肌进行DEGs筛选、功能富集分析并鉴定hub基因，最后选择了MRAS/MAPK信号通路进行实验验证，探究了利拉鲁肽对糖尿病心肌病的保护作用机制。

Identification of key candidate genes and pathways revealing the protective effect of liraglutide on diabetic cardiac muscle by integrated bioinformatics analysis通过生物信息学综合分析确定利拉鲁肽对糖尿病心肌保护作用的候选关键基因和通路

一.研究背景

国际糖尿病联合会(IDF)预计到2040年将有6.42亿糖尿病患者。这种慢性代谢性疾病会引起一系列严重的长期并发症，其中，糖尿病心肌病具有较高的发病率和死亡率。利拉鲁肽是一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，可增强全身性降糖作用，同时对糖尿病并发症具有保护作用，但利拉鲁肽对糖尿病心肌病的具体作用还有待研究。作者希望通过本研究探讨利拉鲁肽对糖尿病患者心肌的保护作用及其机制。

二.分析流程

三.结果解读

1.筛选DEGs

从GEO数据库下载GSE102194数据集，包含6个样本：3个经利拉鲁肽治疗大鼠的心肌和3个对照大鼠的心肌。使用GeneSpring软件筛选DEGs。在利拉鲁肽组中筛选出520个差异表达基因，其中159个下调，361个上调（图1）。

图1 520个DEGs的热图（部分）

2.GO和KEGG富集分析

对DEGs进行GO和KEGG富集分析：

GO分析

生物过程：上调基因主要富集在肌肉系统、肌肉结构发育和解剖结构的形态发生；下调基因主要富集在化学刺激的检测和神经过程（图2A）。
细胞成分：上调基因主要富集在肌节，收缩纤维和投射神经元；下调基因主要富集在细胞膜的组成成分（图2B）。
分子功能：上调基因主要富集在细胞骨架蛋白和离子通道结合；下调基因主要富集在信号受体活性和跨膜信号受体活性（图2C）。

KEGG分析：上调基因主要富集在心肌细胞的肾上腺素能信号转导，多巴胺能突触和昼夜节律；下调基因主要富集在嗅觉传导（图2D）。

图2 GO和KEGG富集分析结果

3.构建PPI网络并进行模块分析

利用STRING数据库和Cytoscape软件构建PPI网络（图3A）。使用Network Analyzer插件计算节点的degree，并选择degree最高的前10个基因作为hub基因，包括Acta1，Actn2，Mapk12，Tnnc2，Actn3，Eno3，Myh1，Mylpf，Pgam2和Pygm。

使用MCODE插件进行模块分析，选择节点数小于4且MCODE得分大于4的模块。并对模块进行KEGG富集分析来明确各个模块的功能。

模块1主要富集于紧密连接，肌动蛋白细胞骨架的调节，糖酵解/糖异生和心肌收缩（图3B）。
模块2主要富集于间隙连接和吞噬小体（图3C）。
模块3主要富集于MAPK信号通路（图3D）。
模块4主要富集于突触囊泡循环（图3E）。

图3 构建PPI网络并进行模块分析

4.GLP-1对高糖应激过程中细胞活性的影响

接下来作者通过实验的方法研究GLP-1的作用机制。首先在H9c2细胞系中建立高糖诱导的应激模型。在培养基中加入D-葡萄糖并达到22mM葡萄糖的终浓度，作为高糖组（high glucose,HG）。以终浓度为5.5mM的葡萄糖作为对照组。然后通过CCK8法测定添加GLP-1后对H9c2细胞活性的影响（图4A）。

向细胞加入GLP-1的量在5-20 nM范围内时，加入GLP-1量越多，H9c2细胞活性提高的越多。
加入40 nM的GLP-1并没有比加入20 nM时提高更多的细胞活性。

图4A 不同浓度的GLP-1 对高糖应激过程中细胞活性的影响

5.GLP-1降低高糖诱导的H9c2细胞凋亡

以往研究表明IL-6、IL-1β和TNF-α在高糖诱导的心肌细胞毒性中有重要作用。因此作者检测了IL-6、IL-1β和TNF-α三个炎症细胞因子的表达水平（图4B）。

与对照组相比，HG组IL-6、IL-1β和TNF-α的水平明显升高。
10 和20 nM的GLP-1处理可明显降低IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平，且20 nM GLP-1组抑制效果更好。

图4B 不同浓度的GLP-1 对高糖诱导下炎症细胞因子分泌的影响

接下来作者使用TUNEL染色试验（图4C,D）和流式细胞仪（图4E）检测细胞凋亡的情况。

与对照组相比HG组细胞凋亡数量明显增加。
20 nM的GLP-1处理明显减少了高糖诱导的细胞凋亡。

图4C-E GLP-1对高糖诱导下细胞凋亡的影响

6.GLP1通过MRAS /MAPK信号通路减轻高糖应激诱导的H9c2细胞凋亡

上文模块分析中KEGG富集分析的结果表明，MRAS和MAPK信号通路可能在GLP-1保护受高糖损伤的H9c2细胞中起重要作用。因此作者接下来通过Western Blot的方法检测了p38、JNK、EKR1/2和MRAS蛋白的表达水平(图5A、B、C、D)。

HG组p38，JNK，EKR1/2和MRAS的水平高于对照组。
GLP-1可以抑制HG组p38、JNK、EKR1/2和MRAS的表达。

以上实验结果证明了利拉鲁肽可以通过MRAS /MAPK信号通路抑制细胞凋亡，来保护糖尿病心肌。

图5 GLP-1降低高糖诱导的MRAS、p38、JNK、ERK1/2的表达

小结

作者从GEO数据库下载经过利拉鲁肽治疗的小鼠心肌测序数据，筛选DEGs并进行GO、KEGG富集分析，随后构建PPI网络，鉴定hub基因并进行模块分析，得到了可供进一步机制研究的候选基因和通路列表。最后作者从中选择了MRAS /MAPK信号通路进行了实验验证。通过此研究，作者为糖尿病心肌病提供新的诊断和治疗靶点，证明了利拉鲁肽可以通过MRAS /MAPK信号通路抑制细胞凋亡，来保护糖尿病心肌。

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编辑：土笋冻

校审：糯米饭虾仁饭