看IF20+的文章怎样用微生物组验证结果

基迪奥生物 · 公众号 · · 2024-09-06 18:33

正文

微生物之间存在很强的相互作用，微生物群落的组成也受到外界环境的广泛影响，因此通过分离培养或简单共培养特定微生物去阐述其在环境中的作用是相对片面的，通过实验+微生物组测序结果挖掘微生物间的动态关系是研究微生物在群落中作用的重要方式。大样本可以通过机器学习或差异分析的方式识别关键的生物标记物，也是排除样本特异性挖掘普遍规律的重要手段，大样本微生物组测序也逐渐成为了验证微生物群落分布规律的重要方式。

在临床的应用中，通过大样本挖掘到目标菌群、基因、代谢物等用于验证先验结论并后续设计实验研究是非常关键的，今天通过一篇 Cell 子刊的客户案例一起来看看如何通过大样本微生物组测序来验证结果并阐述结论的吧~

文章解读

文章题目：

工程益生菌通过恢复肠道菌群和氧化还原稳态来改善溃疡性结肠炎

发表期刊： Cell Host & Microbe （IF=20.6）

合作单位： 中国科学院过程工程研究所

发表时间： 2024年9月

研究背景

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性炎症性肠病（IBD），其特征是持续的炎症，临床表现为腹泻、粪便中带黏液或血液，且慢性患者患结直肠癌的风险增加，人们一直在寻找治疗 UC 的新方法。由于肠道菌群失衡，即有益菌减少，有害菌增多，已被证实与UC 有关，许多科学家将注意力转向细菌疗法以恢复肠道菌群稳态，然而目前益生菌的功效不尽人意，并没有得到广泛认可。清除氧化应激也是治疗UC的有效手段，因此开发可以清除氧化应激的益生菌有望成为治疗UC的强有力方法。

研究思路

第一次16S测序：UC患者与健康者样本（共103个样本），验证数据挖掘结果，确定乳酸杆菌可以作为健康者与UC患者之间的主要区别微生物，且可以作为潜在的调节UC患者肠道菌群的有益菌。

第二次16S测序：小鼠UC模型实验（共30个样本），验证Se-fLac对肠道菌群向健康调节的作用，证明Se-fLac治疗UC的可行性与安全性。

第三次16S测序：NHP（非人灵长类动物）UC模型（共9个样本），验证Se-fLac在灵长类动物中也同样起到调节肠道菌群稳态的作用，进一步说明Se-fLac能够治疗UC的可行性和安全性。

研究过程与结果

通过大样本16S测序验证数据挖掘结果

通过收集数据库中的宏基因组、转录组与单细胞转录组数据分析，发现乳酸杆菌属具有潜在恢复UC治疗微生物群稳态的倾向，氧化应激是靶向干预的关键致病因素，可以通过清除结肠中过量的活性氧（ROS）有效地实现。

为了验证数据分析的结果，收集了一批临床健康捐赠者HD（n=46）和UC患者（n=57）的粪便样品进行16S和8-OHdG测定。统计检验结果显示，乳酸杆菌在HD与UC患者间有显著差异，HD乳酸杆菌相对丰度显著高于UC患者，8-OHdG含量显著低于UC患者。通过相关性分析揭示UC恶化与乳酸杆菌含量间的潜在关联，乳酸杆菌相对丰度、8-OHdG含量与CRP值的相关性分析揭示了三者之间的显著相关性。这些临床样本的结果不仅证实了之前关于乳酸杆菌异常减少和ROS增加的报道，而且还揭示了这两个方面在UC恶化中的密切关联。

图1 数据挖掘与临床验证结果

Se-fLac的构建与通过16S测序验证对小鼠模型肠道菌群的调节作用

选择Lactobacillus casei作为工程菌，通过营养缺乏诱导培养形成功能化具有超小但高活性的硒点和细胞外膜的Se-fLac，通过实验验证了其在肠道中的活性，并且具有调节肠道菌群与清除ROS的能力。构建成功后验证了其对胃酸的耐受性、对肠道的黏附性与在肠道中的存活能力，并在小鼠模型中验证了其治疗效果和安全性，能够有效改善肠道的炎症环境。

进一步通过16S测序验证其对肠道菌群的调节作用，结果显示Se-fLac组显著提高了微生物群落的丰富度和多样性，PCoA分析结果显示，与其他治疗组相比，Se-fLac组与健康组的微生物群落组成更相似。属水平物种组成分析结果显示，Se-fLac组与健康组属水平物种组成更相似，Se-fLac增加了有益菌乳酸杆菌的相对丰度，降低了有害大肠杆菌的相对丰度，这表明Se-fLac有帮助恢复微生物群落稳态的趋势。此外，16S结果表明，Se-fLac组比fLac组有更强的微生物群落调节作用，大多数有害微生物类型为兼性厌氧，这可能与硒点清除活性氧的作用也有关，减少ROS含量可能参与减轻电子受体接到的厌氧呼吸，从而进一步抑制兼性厌氧菌的过度生长；大多数兼性厌氧菌为革兰氏阴性菌，脂多糖（LPS）可以有到氧化应激，抑制兼性厌氧菌的过度生长可能也会抑制ROS的产生。通过实验验证也进一步证实了以上猜测，这种氧化还原与微生物群落稳态的协同恢复合理地解释了Se-fLac强大的治疗效果。

图2 UC小鼠模型验证Se-fLac对肠道菌群的调节作用

通过16S测序验证Se-fLac在UC NHP模型中调节肠道菌群的效果

进一步在与人类更相近的NHP模型中探讨Se-fLac的治疗效果，Se-fLac治疗后，观察期内（6~10天）粪便隐血试验变色时间与健康组相似。收集第11天的粪便样本进行进一步分析，Se-fLac组与健康组8-OHdG水平相近，显著低于PBS组；16S测序结果显示，有益菌群(如Ruminococcaceae)丰度增加，有害菌群(如Prevotellaceae和Lachnospiraceae)丰度降低。Se-fLac处理后，CRP、二胺氧化酶、中性粒细胞、血小板等指标进一步证明，氧化还原和微生物群稳态的恢复进一步导致炎症的显著缓解。结肠镜、组织活检染色结果进一步证明Se-fLac对这些猴子的安全性，加强了Se-fLac作为UC治疗方式的希望。

图3 UC NHP模型进一步验证Se-fLac对肠道菌群的调节作用

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