今天要给大家分享的这篇文章相当有意思，它聚焦于免疫抑制微环境下，TKI（酪氨酸激酶抑制剂）耐药过程所发生的变化。这篇是复旦大学附属华山医院神经外科的博士生发表在 Cell 大子刊上的佳作，该期刊影响因子高达 48.8 分，含金量十足。
文章重点探究的是 LCBM（肺癌脑转移）中的 TKI 耐药问题。想必大家对 TKI 并不陌生，它主要用于抑制 RTK（酪氨酸激酶），像发生突变的 EGFR 就是典型例子。EGFR 这类 RTK 作为诸多信号通路的膜受体，肩负着传递信号的重任（像 MAPK 信号通路、ErbB 信号通路、PI3K - AKT 信号通路、JAK - STAT 信号通路等等。要是对这些信号通路不太熟悉，不妨回去翻翻《信号通路是什么鬼？》系列复习一下）。然而，在 LCBM 的治疗过程中，TKI 耐药现象屡见不鲜。
鉴于此，研究者们不禁思考：TKI 在治疗 LCBM 时，是否会对免疫细胞微环境造成影响，进而促使肿瘤脑转移过程中产生免疫抑制呢？为了找到答案，他们以 LCBM 患者为研究对象，开展了单细胞测序工作。大家看，下面这个 UMAP 图，就是通过单细胞测序获得的（UMAP图是以基因表达作为多维主成因进行分析，随后降维成我们所看到的 2D 图形，借此对具有不同基因表达特征的细胞展开分簇分析，UMAP 和 tSNE 的原理基本一致，在《列文虎克读文献》以及《夏老师带你读文献》中都有相关介绍）。在众多 RTK 突变样本里，研究者们有了新发现：在 NSCLC（非小细胞肺癌）中，EGFR 和 ALK 的突变与 LCBM 里 T 细胞浸润水平降低存在关联。而使用 TKI 药物后，LCBM 却呈现出更高比例的 T 细胞浸润情况。这意味着，内在的 EGFR 和 ALK 驱动突变会干扰免疫微环境，TKI 治疗反而能够增强 T 细胞浸润。
随着研究的深入，对单细胞测序的进一步剖析揭示出，TKI 治疗还具备影响 T 细胞分化的能力。在经 TKI 处理病例的 T 细胞中，经典免疫检查点 CTLA4 出现了明显上调。CTLA4 想必大家都有所耳闻，在免疫检查点领域，它可是与 PD1 齐名，既能抑制 TCR 信号通路，又能借助 SHP1 抑制 PI3K - AKT 信号通路。要是对PI3K-AKT信号通路都还不太熟悉，那就很难快速进入到这篇文章中去了，赶紧去看看《信号通路是什么鬼？》系列。虽说 TKI 能够扭转 EGFR 突变型 LCBM 中的 T 细胞缺陷，可与此同时，它通过上调 CTLA4 表达，削弱了 T 细胞的效应功能。
紧接着，研究者们将目光投向单细胞测序中的另一类免疫细胞群体 ——TAM（肿瘤相关巨噬细胞）。他们发现，经过 TKI 治疗后，MDM（单核细胞衍生的巨噬细胞）和小胶质细胞成为 LCBM 中数量最为丰富的两个髓系细胞亚群。通过单细胞测序的配体受体分析，还观察到 MDMs 和 T 细胞之间展现出更多的配体 - 受体相互作用。由此推测，TKI 治疗后，MDM 和 T 细胞之间或许存在着某种 “交流”，也就是 Crosstalk。迭代出这个假设后，研究者们迅速开展相应实验进行验证（假设的迭代，就是基于已知的信息，对于原有的假设进一步更新的过程，在科研的过程中，也只有通过假设的迭代，才能推进课题的进一步进展，不清楚假设和假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。他们利用 MDMs 和 T 细胞的体外共培养系统，惊喜地发现，用 TKI 处理的肿瘤细胞的条件培养基培养巨噬细胞系，会促使 T 细胞迁移增加。这表明，TKI 治疗后，巨噬细胞能够驱动 T 细胞浸润。
为了让结论更加可靠，研究者们又在小鼠体内进行验证，构建了 LCBM 小鼠模型，深入剖析 TKI 对 LCBM 微环境的影响。结果显示，TKI 确实能够有效抑制肿瘤增殖，可与此同时，它也会增加 T 细胞上 CTLA4 的表达，削弱 T 细胞功能，最终增强并维持免疫抑制微环境。
另外，TKI 还能够诱导 ICD（免疫原性细胞死亡），这是一种具有炎症特性的细胞死亡形式，其典型特征是分泌 DAMP（损伤相关分子模式），诸如 HMGB1 和 CALR 等。通过共聚焦分析，研究者们发现 TKI 治疗能够触发 EGFR 突变型小鼠肺癌细胞中 HMGB1 从细胞核转移至细胞质。而 HMGB1 能够通过 Toll 样受体信号通路激活巨噬细胞的 NFκB 信号（这里的 p65 其实就是 NFκB 信号入核激活转录的关键部分，要是不熟悉这些内容，参考《信号通路是什么鬼？》系列就能了解）。研究者们通过对巨噬细胞逐一使用不同的 TLR 抑制剂排查发现，HMGB1 可以借助 TLR2 激活巨噬细胞的 NFκB 信号，进而促使趋化因子表达。
同样，由 TKI 导致的肿瘤细胞 ICD 所产生的 HMGB1，也会对 T 细胞产生作用。在使用 NFκB 的抑制剂后，研究者们发现，HMGB1 与 NFκB 信号偶联，是上调 T 细胞中 CTLA4 表达的分子驱动因素。不过实事求是地说，这部分验证并非无懈可击，使用抑制剂或者阻断剂进行验证，在逻辑上容易陷入肯定后件的谬误，在严谨的科研逻辑验证过程中，这一点略显不足。要是不清楚肯定后件逻辑谬误，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》以及《信号通路是什么鬼？》系列。此外，HMGB1 还能够促进 NFκB 信号通路中 p65 与 TSS（转录起始位点）附近启动子区域的结合。
简单用示意图呈现就是：TKI 治疗会致使肿瘤细胞发生 ICD，并释放 HMGB1。HMGB1 一方面能够激活巨噬细胞中的 NFκB 信号通路，释放细胞因子招募 T 细胞；另一方面，肿瘤细胞来源的 HMGB1 还能激活 T 细胞中的 NFκB 信号通路，使得 T 细胞的 CTLA4 表达升高，削弱 T 细胞功能，最终营造出免疫抑制微环境。
既然已经明确 CTLA4 是导致免疫抑制微环境的关键因素，且其表达增强又是 TKI 引发的，研究者们灵机一动，提出了新的设想：要是采用 CTLA4 的抑制剂，协同 TKI 进行治疗，会不会取得更理想的效果呢？这其实就是科研中假设的迭代过程，基于研究的不断推进，依据新出现的结果优化假设，要是不太明白假设迭代，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》这本书。带着这个新假设，研究者们开展了小鼠体内实验，结果令人振奋，TKI 与 CTLA4 阻断联合治疗，不仅对 TKI 敏感突变型 LCBM 成效显著，对 TKI 耐药突变型的 LCBM 同样有效。
回顾整个过程，TKI 治疗后，因其引发的 ICD，触发了一系列连锁反应，使得浸润的 T 细胞中 CTLA4 表达上升，进而导致 T 细胞功能出现障碍。而使用 CTLA4 的阻断剂，则如同给 T 细胞注入一剂强心针，让 TME（肿瘤微环境）中的 T 细胞重新焕发生机，发挥应有的功能。
总体而言，今天分享的这篇文章，无论是研究过程，还是研究思路，都有诸多可圈可点之处，当然，在部分验证环节，还是存在一些小瑕疵。好了，今天就先分享到这儿，要是大家感兴趣，不妨去读一读原文，希望各位都能心明眼亮，在科研道路上不断探索前行。
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