今天要给大家分享的这篇文章相当有意思，它聚焦于免疫抑制微环境下，TKI（酪氨酸激酶抑制剂）耐药过程所发生的变化。这篇是复旦大学附属华山医院神经外科的博士生发表在 Cell 大子刊上的佳作，该期刊影响因子高达 48.8 分，含金量十足。
文章重点探究的是 LCBM（肺癌脑转移）中的 TKI 耐药问题。想必大家对 TKI 并不陌生，它主要用于抑制 RTK（酪氨酸激酶），像发生突变的 EGFR 就是典型例子。EGFR 这类 RTK 作为诸多信号通路的膜受体，肩负着传递信号的重任（
像 MAPK 信号通路、ErbB 信号通路、PI3K - AKT 信号通路、JAK - STAT 信号通路等等。要是对这些信号通路不太熟悉，不妨回去翻翻《信号通路是什么鬼？》系列复习一下
）。然而，在 LCBM 的治疗过程中，TKI 耐药现象屡见不鲜。
鉴于此，研究者们不禁思考：TKI 在治疗 LCBM 时，是否会对免疫细胞微环境造成影响，进而促使肿瘤脑转移过程中产生免疫抑制呢？为了找到答案，他们以 LCBM 患者为研究对象，开展了单细胞测序工作。大家看，下面这个 UMAP 图，就是通过单细胞测序获得的（
UMAP图是以基因表达作为多维主成因进行分析，随后降维成我们所看到的 2D 图形，借此对具有不同基因表达特征的细胞展开分簇分析，UMAP 和 tSNE 的原理基本一致，在《列文虎克读文献》以及《夏老师带你读文献》中都有相关介绍
）。在众多 RTK 突变样本里，研究者们有了新发现：在 NSCLC（非小细胞肺癌）中，EGFR 和 ALK 的突变与 LCBM 里 T 细胞浸润水平降低存在关联。而使用 TKI 药物后，LCBM 却呈现出更高比例的 T 细胞浸润情况。这意味着，内在的 EGFR 和 ALK 驱动突变会干扰免疫微环境，TKI 治疗反而能够增强 T 细胞浸润。
随着研究的深入，对单细胞测序的进一步剖析揭示出，TKI 治疗还具备影响 T 细胞分化的能力。在经 TKI 处理病例的 T 细胞中，经典免疫检查点 CTLA4 出现了明显上调。CTLA4 想必大家都有所耳闻，在免疫检查点领域，它可是与 PD1 齐名，既能抑制 TCR 信号通路，又能借助 SHP1 抑制 PI3K - AKT 信号通路。
要是对PI3K-AKT信号通路都还不太熟悉，那就很难快速进入到这篇文章中去了，赶紧去看看《信号通路是什么鬼？》系列
。虽说 TKI 能够扭转 EGFR 突变型 LCBM 中的 T 细胞缺陷，可与此同时，它通过上调 CTLA4 表达，削弱了 T 细胞的效应功能。
紧接着，研究者们将目光投向单细胞测序中的另一类免疫细胞群体 ——TAM（肿瘤相关巨噬细胞）。他们发现，经过 TKI 治疗后，MDM（单核细胞衍生的巨噬细胞）和小胶质细胞成为 LCBM 中数量最为丰富的两个髓系细胞亚群。通过单细胞测序的配体受体分析，还观察到 MDMs 和 T 细胞之间展现出更多的配体 - 受体相互作用。由此推测，TKI 治疗后，MDM 和 T 细胞之间或许存在着某种 “交流”，也就是 Crosstalk。迭代出这个假设后，研究者们迅速开展相应实验进行验证（
假设的迭代，就是基于已知的信息，对于原有的假设进一步更新的过程，在科研的过程中，也只有通过假设的迭代，才能推进课题的进一步进展，不清楚假设和假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列
）。他们利用 MDMs 和 T 细胞的体外共培养系统，惊喜地发现，用 TKI 处理的肿瘤细胞的条件培养基培养巨噬细胞系，会促使 T 细胞迁移增加。这表明，TKI 治疗后，巨噬细胞能够驱动 T 细胞浸润。
为了让结论更加可靠，研究者们又在小鼠体内进行验证，构建了 LCBM 小鼠模型，深入剖析 TKI 对 LCBM 微环境的影响。结果显示，TKI 确实能够有效抑制肿瘤增殖，可与此同时，它也会增加 T 细胞上 CTLA4 的表达，削弱 T 细胞功能，最终增强并维持免疫抑制微环境。
另外，TKI 还能够诱导 ICD（免疫原性细胞死亡），这是一种具有炎症特性的细胞死亡形式，其典型特征是分泌 DAMP（损伤相关分子模式），诸如 HMGB1 和 CALR 等。通过共聚焦分析，研究者们发现 TKI 治疗能够触发 EGFR 突变型小鼠肺癌细胞中 HMGB1 从细胞核转移至细胞质。而 HMGB1 能够通过 Toll 样受体信号通路激活巨噬细胞的 NFκB 信号（
这里的 p65 其实就是 NFκB 信号入核激活转录的关键部分，要是不熟悉这些内容，参考《信号通路是什么鬼？》系列就能了解
）。研究者们通过对巨噬细胞逐一使用不同的 TLR 抑制剂排查发现，HMGB1 可以借助 TLR2 激活巨噬细胞的 NFκB 信号，进而促使趋化因子表达。
同样，由 TKI 导致的肿瘤细胞 ICD 所产生的 HMGB1，也会对 T 细胞产生作用。在使用 NFκB 的抑制剂后，研究者们发现，HMGB1 与 NFκB 信号偶联，是上调 T 细胞中 CTLA4 表达的分子驱动因素。不过实事求是地说，这部分验证并非无懈可击，使用抑制剂或者阻断剂进行验证，在逻辑上容易陷入肯定后件的谬误，在严谨的科研逻辑验证过程中，这一点略显不足。
要是不清楚肯定后件逻辑谬误，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》以及《信号通路是什么鬼？》系列
。此外，HMGB1 还能够促进 NFκB 信号通路中 p65 与 TSS（转录起始位点）附近启动子区域的结合。
简单用示意图呈现就是：TKI 治疗会致使肿瘤细胞发生 ICD，并释放 HMGB1。HMGB1 一方面能够激活巨噬细胞中的 NFκB 信号通路，释放细胞因子招募 T 细胞；另一方面，肿瘤细胞来源的 HMGB1 还能激活 T 细胞中的 NFκB 信号通路，使得 T 细胞的 CTLA4 表达升高，削弱 T 细胞功能，最终营造出免疫抑制微环境。
既然已经明确 CTLA4 是导致免疫抑制微环境的关键因素，且其表达增强又是 TKI 引发的，研究者们灵机一动，提出了新的设想：要是采用 CTLA4 的抑制剂，协同 TKI 进行治疗，会不会取得更理想的效果呢？这其实就是科研中假设的迭代过程，基于研究的不断推进，依据新出现的结果优化假设，
要是不太明白假设迭代，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》这本书
。带着这个新假设，研究者们开展了小鼠体内实验，结果令人振奋，TKI 与 CTLA4 阻断联合治疗，不仅对 TKI 敏感突变型 LCBM 成效显著，对 TKI 耐药突变型的 LCBM 同样有效。
回顾整个过程，TKI 治疗后，因其引发的 ICD，触发了一系列连锁反应，使得浸润的 T 细胞中 CTLA4 表达上升，进而导致 T 细胞功能出现障碍。而使用 CTLA4 的阻断剂，则如同给 T 细胞注入一剂强心针，让 TME（肿瘤微环境）中的 T 细胞重新焕发生机，发挥应有的功能。
总体而言，今天分享的这篇文章，无论是研究过程，还是研究思路，都有诸多可圈可点之处，当然，在部分验证环节，还是存在一些小瑕疵。好了，今天就先分享到这儿，要是大家感兴趣，不妨去读一读原文，希望各位都能心明眼亮，在科研道路上不断探索前行。
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