泛素化（ubiquitination）是一种关键的翻译后修饰，通过将泛素（Ub）连接到靶蛋白，调控蛋白降解、信号转导等多种生物学过程。E2泛素结合酶在决定泛素化位点和类型中起核心作用，但其在活细胞内的特异性功能尚不清楚。现有方法在解析E2特异性泛素化时受到空间位阻等限制，亟需开发更高效的工具。

2025年1月6日， 清华大学药学院 尹航教授 （通讯作者）和课题组成员 博士生沈思奇 （第一作者）两人在 Nature Chemical Biology 期刊上发表了一篇名为：E2–Ub-R74G strategy reveals E2-specific ubiquitin conjugation profiles in live cells的论文。

该论文开发了FUSEP（fusion E2–Ub-R74G profiling）策略，通过标记特异的LGGG残基并结合质谱分析，系统解析E2酶的泛素化模式，包括赖氨酸和非赖氨酸泛素化。该方法揭示了E2酶在非赖氨酸泛素化中的新作用，首次发现酪氨酸泛素化，并鉴定了与UBE2D3协作的E3连接酶RNF149及其调控焦亡的功能。这一工具为理解泛素化机制和开发治疗策略提供了新思路。

FUSEP策略的设计与验证

通过在E2与Ub之间引入特异性突变Ub-R74G和灵活连接子，该策略确保HA-Ub能被细胞E1Ub激活并由探针特异性E2优先加载，实现对E2特异性底物的标记。图中验证了fUBE2D3-HA-Ub探针的稳定性、活性及其与内源性E2的低竞争性，确保其能反映细胞中真实的E2活性。Ub-R74G突变生成特异性LGGG残基，结合LC-MS/MS分析，可系统解析赖氨酸和非赖氨酸泛素化模式。通过探针优化和细胞内实验，确认了策略的高灵敏性与特异性。

图1：基于fE2–HA-Ub探针的开发与细胞验证。

E2-E3配对及其特异性底物

通过fUBE2D3–HA-Ub-R74G探针，揭示了E2特异性泛素化位点，确认了多个E3连接酶（如RNF149和NOSIP）与E2配对的可能性。探针标记实验在不同细胞系中进行，结合LFQ分析，鉴定了参与泛素化途径的蛋白。通过诱导突变和功能验证，进一步解析了RNF149特定赖氨酸位点的功能。该策略能够系统性解析E2特异性泛素化及其调控网络，为研究泛素化通路提供了新工具。

图2：tE2~HA-Ub和fE2–HA-Ub介导的泛素连接特性分析。

E2酶介导的非赖氨酸泛素化特性

羟胺处理裂解泛素氧酯键，显著降低由UBE2J2、UBE2Q1等E2酶标记的高分子量（HMW）蛋白信号，显示其非赖氨酸泛素化特性。UBE2D3和HOIP共表达实验进一步支持丝氨酸/苏氨酸泛素化的可能性。结合JOSD1去泛素化实验验证，确认了多种E2酶在非赖氨酸泛素化中的功能。LC–MS/MS筛选发现CUL1蛋白可能具有酪氨酸泛素化修饰，为研究非赖氨酸泛素化提供了重要线索。

图3：通过E2–Ub-R74G探针和羟胺处理分析E2特异性非赖氨酸泛素化。

人类CUL1蛋白的酪氨酸（Y99）可能存在新的泛素化修饰形式

Y99位点的GG修饰谱图在不同构建体中被检测到，突变分析显示Y99突变为苯丙氨酸减少高分子量（HMW）CUL1比例，而突变为赖氨酸增强HMW泛素化信号。采用o-硝基苯基酪氨酸（ONBY）封闭Y99的羟基也减少了HMW带。进一步验证还发现OGT蛋白在Y112和Y384位点存在酪氨酸泛素化，为非赖氨酸泛素化研究提供了新视角。

图4：鉴定在酪氨酸上具有不同功能的新型泛素化类型，作用于CUL1。

UBE2D3与RNF149在免疫细胞中的功能

RNF149与UBE2D3在细胞膜附近共定位，参与泛素化修饰。体外实验表明RNF149通过K6或K27链接形成HMW泛素链，并将炎症小体调节因子ASC作为底物。RNF149过表达增加ASC的HMW带，而RNF149敲低通过shRNA增强ASC表达，且促进THP-1巨噬细胞中GSDMD裂解，从而增强焦亡反应。进一步实验表明，GST–ASC可以下拉RNF149，表明两者直接作用。MG-132处理验证RNF149介导的ASC降解依赖于蛋白酶体途径。

图5：RNF149是一种单跨膜泛素连接酶，可泛素化并降解ASC。

【 小结 】

FUSEP策略使用fE2–Ub-R74G探针填补了研究E2特异性泛素化的空白，能够区分E2特异性的泛素化谱与整体泛素化谱，从而为研究E2酶的作用提供了更高的分辨率。该方法有助于深入了解非赖氨酸泛素化过程，并能揭示E2酶如何与不同的E3连接酶进行相互作用。研究还发现，CUL1中的酪氨酸泛素化是一种新型的翻译后修饰类型，提示泛素化可能在不同氨基酸上具有细致的调控机制。此外，研究表明，了解非赖氨酸泛素化可能为技术进步和治疗应用提供新的方向。

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