图解三代测序（Nanopore）

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测序原理

时代车轮滚滚向前，也推动着测序技术更新了一代又一代。目前的 Nanopore 三代测序作为最新的测序技术，成为探索生命奥秘的新宠，活跃在各大期刊。今天，我们通过图解的方式来一步步了解这项测序技术。

先来介绍 Nanopore 三代测序中的几位主角：

Reader ：在自然界中，有一种可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白纳米孔。经过人为基因工程修饰后，得到的就是 Nanopore 测序所需的 Reader 蛋白。

Membrane ：Reader 蛋白会被嵌入到高电阻率的 Membrane （人工合成的多聚物膜），膜两侧是离子溶液，在两侧加不同的电位，离子就会在孔中流动，形成电流。

Motor ：在 Nanopore 文库构建时，需要在接头上连接一种动力蛋白，用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。以DNA解螺旋酶作为 Motor（动力蛋白）为例，它可以除了可以解开双螺旋，使之变为单链，还可以提供推动力。

Tether ：该蛋白用于锚定DNA或RNA链，防止在溶液中飘动，并使其进入纳米孔中。

这时，解开的其中一条链会穿过蛋白质孔，它在通过蛋白孔时，会对膜两边离子的稳定流动产生扰动。不同的碱基，对离子流的影响不同，也就会产生不同的电流大小，进而形成下面的电流信号图。

利用这些电流信号，使用计算机软件识别后，推断出碱基类型，完成测序。

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测序仪介绍

虽然 Nanopore 测序仪种类很多，但都是基于Nanopore芯片来搭建的平台，大到由多个芯片阵列组成的PromehION，GridION系列测序仪，小到可以连接手机的Type C，电脑USB的MnION系列便携式测序仪。

这里边，最著名的就是MnION系列，2016年8月，美国宇航员凯特·鲁宾斯在国际空间站完成微重力条件的DNA测序。

它在测序时，一般像下图这样连接就行，显而易见的便携性。比如，可以直接用它在深入疫区采集样本后进行实时分析，为防疫工作争取大量宝贵的时间和资源。

测序时，将制备好的文库或样本溶液，滴在芯片小孔中，开始测序。

一张芯片中有 2048 个 membrane wells，也就是芯片上的一个孔，每个孔包含一个nanopore Reader。

每四个 wells 共享一个 Amplifier（信号放大器），一张芯片中有 512 个信号放大器，也就是 512 组 wells。

在启动测序仪后，机器自检，会将每组 wells 中依据效率高低排序。测序开始，仪器先用每组 wells 中效率最高的 wells，运行 8 小时后，更换效率第二的，以此类推。

但是，在实际使用过程中，只有 1200 个 wells可以正常工作。

造成 wells 失效的原因：

• wells 中没有 Reader 蛋白，或纳米孔不通，这时无电信号

• 膜破损，这时有强电信号，不能正常测序

• 在单个 well 中有两个及以上的 Reader 蛋白，电信号互相干扰

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建库方法

1、1D 文库

1D文库是将DNA双链，解链为正义链与反义链，分别测序，大约有 85% 的碱基判读准确率。

目前 1D文库 有两种建库方案：

标准建库

• 将 DNA 打断

• 补齐DNA末端，末端加 A 碱基

• 连接 Adapter（ 接头序列），接头上连有 Motor 蛋白

• 接头中有一段序列可以与 Tether 蛋白结合，作用是为了将 DNA 链吸附在膜上，将 DNA 锚定，不易被溶液洗走

  下图是 Tether 与接头序列识别及锚定过程

  

转座酶建库

• 建库时使用连有测序接头的转座酶，该酶可以将长链 DNA 链切断

• 由于该酶的特性，会在DNA的断点两端加接头序列

• 随后在测序接头加入 Motor 蛋白

文库

在 DNA 两侧接 接头，其他步骤和 1D 文库类似。

这种文库中的 接头，可以让第二链紧跟第一链来一起测序。

由于可以测到两条链，可以相互矫正，进而提高判读准确率，能达到 90%以上的碱基判读准确率。