Plus深读 | Nature Letter系统分析1699例儿童白血病和实体瘤基因组和转录组

原文链接：

http://www.nature.com/articles/nature25795

泛癌分析是指对多种类型癌症系统分析其分子异常，确定不同细胞来源癌症中重要的异常生物学进程的共性和差异。泛癌分析已用于成年人癌症分析 ^1-3 ，然而，在儿童癌症分析中尚未见报道。来自美国圣裘德儿童研究医院的Jinghui Zhang课题组对六种不同类型的1699例儿童白血病和实体瘤进行全基因组测序、全外显子测序和转录组测序，并系统分析单核苷酸突变（single nucleotide variants，SNVs）、插入缺失（small insertions or deletions，indels）、结构突变（structural variations，SV）拷贝数改变（copy number alterations，CNAs）和内部串联重复（internal tandem duplications，ITDs）等体细胞突变。该研究提供了全面的儿童癌症基因组结构，强调儿童癌症精确治疗的特殊发展需要。

一、实验设计及分析流程

1、样品收集

分别从1699例儿童肿瘤病人中收集配对的正常组织和肿瘤组织，具体分类如下：

（1）B系急性淋巴细胞性白血病（B-lineage acute lymphoblastic leukaemias，B-ALL）：689例；

（2）T系急性淋巴细胞性白血病（T-ALL）：267例；

（3）急性髓系白血病（acute myeloid leukaemias，AML）：210例；

（4）神经母细胞瘤（neuroblastomas，NBL）：316例；

（5）Wilms瘤（Wilms tumours，WT）：128例；

（6）骨肉瘤（osteosarcomas，OS）：89例。

综上，分别收集六种不同类型的儿童肿瘤，其中98.5%病人年龄低于20岁。

2、主要测序技术

（1）全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）

（2）全外显子测序（whole-exome sequencing，WES）：利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法；

（3）转录组测序（transcriptome sequencing）：RNA-seq。

3、数据分析

分析流程如图1所示，在完成测序后，首先对测序结果进行质控，具体分析如下：

（1）全基因组测序分析：从TARGET Data Matrix数据库下载SNVs、indels和结构突变等突变注释文件比对分析；

（2）全外显子测序分析：使用Bambino程序检测体细胞体细胞SNVs和indels ⁴ ；

（3）RNA-seq数据分析：使用StrongArm匹配测序数据，通过CICERO确定RNA融合 ⁵ 。

图1.数据分析流程图

最终，该研究小组在儿童肿瘤中确定了142个驱动基因，其中45%与成人癌症相匹配；此外，CNAs和SV在体细胞突变中占62%。

二、实验结果

1、体细胞突变率及特点

（1）如图2a和2b所示，体细胞突变率中位数在儿童肿瘤中较低，由0.17/Mb（AML）至0.79/Mb（OS），而在成人癌症中是1-10/Mb ⁶ ；

（2）如图2c和2e所示，儿童肿瘤中有11种突变类型（T1~T11），T10和T11是新发现的体细胞突变，伴随着低的等位基因突变率（＜0.3），分别在WT和AML中较多；

（3）在不同的儿童肿瘤体细胞突变中，T1和T4（clock-like endogenous mutational processes）占比最高：T-ALL (97%)、AML (63%)、B-ALL (36%)和WT（28%）。

图2.体细胞突变率及特点

2、肿瘤驱动基因筛选及特点

该研究在儿童肿瘤中确定了142个显著突变的驱动基因，并列举了前100个基因，如图3a所示，其中CDKN2A突变率最高，在T-ALLs、B-ALLs和OS中分别为78%、42%和11%。此外，儿童肿瘤驱动基因具有一定的特点，如下，

（1）该研究发现的78（＞50%）个驱动基因是成人泛癌研究未曾发现的；

（2）在白血病和NBL中，40%~50%点突变具有较低的等位基因突变（＜0.3），暗示亚克隆突变促进儿童肿瘤发生；

图3.儿童癌症中候选驱动基因

（3）同一基因突变具有不同类型，如STAG2，有5种不同的体细胞突变，SNVs、indels、CNAs、ITDs和SV；

（4）如图3b所示，两个突变基因间存在共存和互斥的关系，该研究发现新的配对基因，如ETV6和IKZF1在AML中共存，而SHANK2和MYCN在NBL中互斥。

3、解析体细胞突变及相关的生物学进程

该研究中使用了WGS和WES分析体细胞突变，如图4a所示，其中轻灰指点突变，深灰指CNAs或SV，黑色值指点突变及CNAs或SV，两者检测出的点突变是高度一致的，但WGS更能检测出儿童肿瘤中CNAs和SV。本研究共发现了与儿童肿瘤发生相关的21条生物学通路，如图4b和4c，其特点如下：

（1）不同类型儿童肿瘤间存在相同的生物学通路异常，如细胞周期和表观调控；

（2）有些生物学通路存在组织特异性，如JAK-STAT、Wnt/β-catenin和NOTCH信号通路；

（3）不同类型儿童肿瘤间相同生物学通路突变的基因不同，如RAS，JAK-STAT和PI3K信号通路，ALK、NF1和PTEN主要在实体瘤中发生突变，几乎所有的FLT3、PIK3CA、PIK3R1和RAS突变在白血病中都存在；

图4.儿童肿瘤中体细胞突变相关生物学进程

此外，许多生物学进程在儿童肿瘤与成人肿瘤都是异常，其影响基因既具有相同性，如细胞周期基因和表观调控基因，也具有特异性，如转录因子和JAK-STAT信号通路基因是儿童肿瘤特异的。

4、 突变等位基因表达分析及特点

突变等位基因表达检测能有效评估基因产物作用，为揭示等位基因表达失衡的表观调控提供了可能。该研究通过比对WGS和RNA-seq数据分析不同类型儿童肿瘤中6959个编码突变，发现这些突变中34%是等位基因突变，如图5所示，其特点如下：

（1）突变等位基因表达与DNA MAF高度相关；

（2）多数（76%）截断突变抑制突变等位基因表达，但多数（87%）热点突变促进突变等位基因表达；

（3）等位基因特异性表达分析不能有效检测亚克隆杂合性缺失，可采用单细胞测序技术解决，如，在不同的亚克隆细胞中发现分别WT1 D447N和11p LOH。

图5.等位基因表达分析

三、讨论和展望

该研究联合WGS、WES和RNA-seq对1699例儿童肿瘤进行泛癌分析，同时应用单细胞测序技术有效检测亚克隆杂合性缺失，这一大数据分析为我们提供了一份详尽的儿童肿瘤基因组图谱，不仅为临床研发儿童肿瘤专用药物奠定了分子基础，而且为基础研究儿童肿瘤的分子机制指明了方向。

该研究发现表观遗传生物学通路的发生率在T-ALL、B-ALL、AML、NBL、WT和OS中分别为53.7%、38.7%、34%、17.6%、12.3%和47.4%，这提示我们表观遗传在儿童白血病和实体瘤中起着重要作用；此外，在Top 100 候选的驱动基因中，PHF6（13/100）、KMT2A（14/100）、KMT2D（28/100）和SETD2（34/100）等组蛋白修饰相关基因排名靠前，提示我们组蛋白修饰在儿童肿瘤发生中扮演重要角色，未来可通过 ChIP-seq （Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）解析儿童肿瘤中染色体组蛋白甲基化、乙酰化和泛素化等修饰 ⁷ ，为精准医疗提供理论依据。

参考文献

1. Kandoth, C. et al. Mutational landscape and significance across 12 major cancer types. Nature 502 , 333-339 (2013).

2. Leiserson, M.D. et al. Pan-cancer network analysis identifies combinations of rare somatic mutations across pathways and protein complexes. Nat Genet 47 , 106-14 (2015).

3. Lawrence, M.S. et al. Discovery and saturation analysis of cancer genes across 21 tumour types. Nature 505 , 495-501 (2014).

4. Edmonson, M.N. et al. Bambino: a variant detector and alignment viewer for next-generation sequencing data in the SAM/BAM format. Bioinformatics 27 , 865-6 (2011).

5. Zhang, J. et al. Germline Mutations in Predisposition Genes in Pediatric Cancer. N Engl J Med 373 , 2336-2346 (2015).

6. Alexandrov, L.B. et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature 500 , 415-21 (2013).

7. Park, P.J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet 10 , 669-80 (2009).