干货|量子点免疫荧光组织化学实验宝典

量子点免疫荧光组织化学（ Quantum Dots based Immunohistochemistry, QD-IHC ）又称量子点免疫荧光细胞化学，是根据抗原 — 抗体特异性结合的原理，用量子点标记特异性抗体作为探针，检测组织或细胞中抗原性物质的一种技术。量子点免疫荧光组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以量子点标记一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和量子点标记二抗，形成抗原 — 一抗 — 二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有更高的敏感性。

量子点，又称为纳米晶，是一种由 II － VI 族或 III － V 族元素组成的 纳米颗粒 ，其粒径介于 1 ～ 10nm 之间。由于电子和 空穴 被量子限域，连续的 能带结构 变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可发射 荧光 。它具有以下主要性质： (l) 量子点的 发射光谱 可通过改变量子点的尺寸和化学组分来控制，波长覆盖整个可见光区； (2) 量子点具有很好的光稳定性，与最常用的有机荧光材料 “ 罗丹明 6G” 相比，其荧光强度高 20 倍，稳定性高 100 倍以上； (3) 量子点具有宽的激发谱和窄的发射谱，可以实现一元激发，多元发射，且多色量子点间不出现 光谱 交叠； (4) 量子点具有较大的 斯托克斯位移 ，可以避免发射光谱与 激发光谱 的重叠； (5) 生物相容性好，量子点经过各种 化学修饰 之后，可以进行特异性标记； (6) 量子点的荧光寿命长。有机 荧光染料 的 荧光寿命 一般仅为几纳秒 ( 这与很多生物样本的自发荧光衰减的时间相当），而量子点的荧光寿命可持续数十纳秒（ 20ns ∽ 50ns) ，这使得光激发后，大多数生物自发荧光已经衰变，而量子点荧光仍然存在，此时即可得到无背景干扰的荧光信号。

与传统的染料分子相比，量子点具有多种优势，是一种理想的荧光探针。比如可承受多次激发和光发射；持久的稳定性可以让研究人员更长时间地观测细胞和组织；量子点色彩丰富，可观察生物体系的复杂性。量子点特殊的光学性质使得它在 生物化学 、 分子生物学 、 细胞生物学 、 基因组学 、 蛋白质组学 、 药物筛选 、 生物大分子 相互作用 等研究中有极大的应用前景。

图 2 量子点的组成及其性质

1. 标本准备

①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理

②冰冻组织切片：由病理室常规处理

③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到 60 ％以上后取出玻片， 4% 多聚甲醛固定 2 h 。

2. 试剂准备

①抗体选择

单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体的缺点，但是可能出现非特异性杂交。因此，不论选择单克隆还是多克隆抗体，最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做 IHC 的抗体，抗体说明书上必须有 IHC 测试结果。如果该分子文献报道较多，可选择文献上常用的经典抗体。

②一抗与二抗

通常一抗有小鼠、大鼠、兔、人和豚鼠等动物源性；常规二抗包括羊抗鼠、羊抗兔、羊抗人、兔抗鼠、兔抗人等。

③量子点 QD _610nm

QD _610nm 激发波长为 UV<400nm ；发射波长 610nm 。

④其他试剂

二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠

3. 抗体特异性验证

所有免疫组化抗体均须 Western blot 验证抗体特异性，并需免疫荧光实验验证抗原定位。

4. 耗材准备

免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片

5. 溶液配制

①磷酸盐缓冲液（ PBS ）

10×PBS 母液配制

NaCl                                  72 g

Na ₂ HPO ₄ ·12H ₂ O              37.3 g

KH ₂ PO ₄ 4.3g

加蒸馏水至 1000 ml ，充分混匀贮存。

使用时用蒸馏水 10 倍稀释，调整 pH 值至 7.3—7.4 。

②柠檬酸抗原修复液

抗原修复使用柠檬酸 - 磷酸氢二钠缓冲液，配方如下：

称取柠檬酸 10.5 g ，溶于 500 ml 蒸馏水；称取 Na ₂ HPO ₄ ·12H ₂ O 57.3g ，溶于 800 ml 蒸馏水。分别量取 358 ml 柠檬酸溶液和 642 ml Na ₂ HPO ₄ 溶液，充分混匀后调整 pH 值至 6.0 ，即得 2× 母液，贮存备用。

③ 1% 盐酸酒精

浓盐酸与 75% 酒精按照 1:99 比例混合，充分混匀。

1. 组织片脱蜡水化

①将组织片依次放入 3 个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸 15 min 。

②依次放入 2 个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸 5 min 。

③依次放入 2 个装有 95% 乙醇的玻璃缸，每缸 5 min 。

④依次放入 90 ％乙醇、 85 ％乙醇、 75% 乙醇的玻璃缸，每缸 2 min ，取出。

⑤放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复 3 次。

2. 抗原修复

将切片浸入 1× 柠檬酸 - 磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热 2 min ，然后停止加热让切片自然冷却。

注意：抗原修复过度或不足，均会影响最终染色结果。切片骤冷可致脱片，必须自然冷却！

3. 封闭内源性过氧化氢酶

①放入 3% H ₂ O ₂ 溶液的玻璃缸中，浸泡 15 min 。

②放入蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复 3 次。

③放入 PBS 缓冲液的玻璃缸中，浸泡 5 min 。

4. 抗原抗体反应

①甩去 PBS 余液，将组织片平辅在湿盒中，加正常山羊血清 1 滴 20 µl （根据组织大小调整用量）， 28 ℃放置 20 min ，甩干。

②直接法：加稀释好的量子点标记一抗；间接法：加稀释好的一抗 1 滴（ 20~50 µl ，根据组织块大小进行调整），置于湿盒 4 ℃过夜。

③置 PBS 缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗 5 min ，更换 PBS 缓冲液，同法操作 4 次，甩干。

④间接法：量子点标记的二抗 20~50 µl （根据组织块大小进行调整），放置湿盒， 37 ℃放置 20 min 。

⑤置 PBS 缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗 5 min ，更换 PBS 缓冲液，同法操作 3 次，甩干。

5. 荧光显微镜下进行观察

将直接法与间接法荧光染色的切片至于荧光显微镜下观察，选择激发波长为