图1显示了正离子模式下SDP样品的总离子流图。对原始质谱数据进行定性和定量分析后，我们从SDP样品中成功鉴定出1824种次生代谢物。我们共鉴定出231种生物碱、197种黄酮类化合物、148种有机酸、141种游离脂肪酸、134种木脂素、84种糖和74种三萜及其衍生物。梯度洗脱条件如表1所示，表2总结了SDP中前26种化学成分的相对含量。

图1 正离子模式下样品质谱检测的SDP总离子流图。

表1 梯度洗脱条件

表2 SDP化学成分相关信息表

在早期的研究中，SDP中发现了高含量的木脂素，UPLC-MS/MS中发现了相对高含量的木质素，这与木脂素在南五味子药效中起主要作用的观点是一致的。因此，我们对南五味子中含量较高的八种木脂素进行了测定，以阐明其物质基础。在SDP中，我们获得了以下值：Schisantherin A（58.70mg/g）、Schisantherin B（29.37mg/g）、Schisantherin C（9.76mg/g）、Schisanhenol（28.39mg/g）和Anwulignan（75.96mg/g）。八种木脂素的总含量为31.58%，为SDP在T2DM大鼠中的药效学研究提供了物质基础。

各组大鼠器官指数结果如图3所示。结果分析表明，Mod组大鼠肝脏指数高于NC组，差异有统计学意义（P<0.05），Mod组肾脏指数高于NC，差异有显著性意义（P<0.01），Mod组大鼠胰腺指数小于NC，差异显著（P<0.01）。综合表明T2DM影响SD大鼠器官。SDP给药4周后，所有器官均显示出不同程度的恢复。

最近的研究表明，五味子可以通过模型生物学方法缓解2型糖尿病的症状。与这些发现一致，我们的研究还观察了SDP对T2DM大鼠的治疗作用。每周动态FBG测量显示，SDP从第二周开始显著降低了FBG水平，并在此后保持了这一降低。为了进一步评估SDP对T2DM大鼠的治疗效果，我们进行了OGTT并评估了生化指标。OGTT结果表明，SDP可以防止血糖水平的显著升高（图4），反映了葡萄糖耐量的改善。此外，由于血脂异常是2型糖尿病的关键因素，我们的研究发现SDP有效地改善了血脂状况。经过四周的SDP处理后，血清和肝脏中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL-C）均显著降低，高密度脂蛋白（HDL-C）显著升高。FFA水平升高会引发胰岛素抵抗并损害β细胞功能。与其他研究的结果一致，我们发现SDP能有效降低血清和肝脏中的FFA水平，差异具有统计学意义（P<0.01）。ELISA检测结果显示，与NC组相比，Mod大鼠的肝脏Ins、GHb、乳酸和丙酮酸水平显著升高（P<0.01）。给药后，Met组和SDP各剂量组对大鼠Ins、GHb、乳酸和丙酮酸的异常水平有不同程度的调节作用。综上所述，四种ELISA检测结果表明，SDP-Hig是最有效的，可以更有效地调节异常水平（图6）。T2DM影响SD大鼠肝脏GSH和T-AOC水平，导致其显著降低（P<0.01）。SDP给药后，GSH和T-AOC水平不同程度地恢复，与Mod组相比，三个给药组均显示出显著差异。

图5 对各组大鼠血清和肝脏中TC（a，e）、TG（b，f）、LDL-C（C，g）和HDL-C（d，h）的影响。与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Mod组相比，#P<0.05，##P<0.01。

PAS染色的结果可以反映肝糖原的合成。肝糖原病理学结果（图7）显示，NC组肝细胞PAS染色均匀完整，细胞核呈蓝色，糖原呈深紫色，细胞排列整齐完整；在模型对照组中，颜色显著加深，肝组织中分布着大量糖原，细胞排列紊乱和变形；与Mod相比，SDP组的SDP Low、SDP Mid和SDP Hig组的PAS染色颜色有不同程度的减轻，SDP Low和SDP Mid的变化更为明显。

组织病理学检查结果（图8）显示，NC的肝组织结构完整，细胞核清晰可见，肝叶结构和细胞排列整齐，未发现脂肪变性和真空细胞变性现象，无明显病理变化。与NC相比，Mod的肝组织细胞排列紊乱，有大片肝细胞水肿，细胞轮廓不清晰，表现为气球样变性、肝细胞核移位和炎性细胞浸润。Met对照组、SDP低、SDP-Mid和SDP-Hig的肝细胞肿胀相对轻微，排列相对整齐，上述所有情况都有所改善。

SDP对大鼠胰腺组织的病理作用（图9）表明，NC中胰岛的结构清晰规则，边界清晰，胰岛细胞排列有序，形态清晰。Mod组大鼠胰腺组织明显受损，胰岛数量减少，胰岛β细胞明显减少、萎缩、肿胀；与Mod相比，Met、SDP low、SDP Mid和SDP Hig中的胰岛细胞数量增加，形态结构得到改善。

与NC相比，模型组INS和Ki67蛋白的表达显著降低，具有统计学意义（P<0.01），经SDP治疗后，所有给药组的表达均有所下降，其中SDP-Hig组有显著性差异（P<0.05），表明SDP-Hig改善了T2DM大鼠胰腺中INS和Ki67蛋白的减少。

在细胞凋亡中，染色使细胞核染色，因此呈现绿色，而正常细胞核则呈现蓝色。在荧光显微镜下，与NC相比，Mod中的细胞核显著减少，凋亡囊泡增加，而与之相比，SDP low、SDP Mid和SDP Hig中的凋亡囊泡显著减少（图11）。

免疫印迹分析数据表明，与NC相比，Mod大鼠的p-IRS/IRS、p-mTOR/mTOR和p-S6K1/S6K1的表达水平显著升高（p<0.01），p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT显著降低（p>0.05或p<0.01）。给药后，Met、SDP低、SDP-Mid和SDP-Hig组出现恢复p-IRS/IRS、p-mTOR/mTOR和p-S6K1/S6K1异常水平的趋势（p>0.05或p<0.05或p<0.01），并调节了p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的异常水平（p>0.05或<0.05或p<0.01）。SDP Hig组效果最好（图12）。SDP还可以影响胰腺中甜味受体蛋白的表达。与NC相比，Mod大鼠TRPM5、T1R3、T1R2和GLP-1的表达水平显著降低（P>0.05和P<0.01）。给药后，Met、SDP低和SDP-Mid组显示出一定的恢复TRPM5、T1R3、T1R2和GLP-1异常水平的趋势（P>0.05或P<0.05或P<0.01），SDP-Hig显示出显著的恢复趋势（P<0.05或P<0.01）（图13A）。

为了研究胰腺STR的生理作用以及SDP对T2DM大鼠这些受体的影响，我们评估了STR信号分子和GLP-1的mRNA表达水平，研究结果如图13A所示。我们在胰腺和肠道中观察到类似的mRNA表达模式。在胰腺中，与NC相比，T2DM大鼠的GLP-1、TRPM5、T1R3和T1R2的mRNA水平显著降低（P>0.05或P<0.01）。SDP抵消了T2DM大鼠胰腺中mRNA表达的这些减少。特别是，SDP-Hig显著恢复了GLP-1、TRPM5、T1R3和T1R2的mRNA水平（P<0.05或P<0.01）。这些发现表明，SDP可能通过上调T2DM大鼠胰腺中STR信号分子（包括GLP-1、TRPM5、T1R3和T1R2）的表达来增强胰岛素分泌（图13B）。

图13 SDP对大鼠肝组织LKB1、AMPK、PI3K、AKT、IRS-1、mTOR和S6K1的影响。 （A）蛋白质印迹分析结果。（B）mRNA表达结果。数据以平均值±SEM表示（n=3）。与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Mod组相比，#P<0.05，##P<0.01。

图14显示了使用上述LC-MS分析方法以正离子模式分析的大鼠尿液样本的代表性TIC图。NC和Mod的代谢特征存在显著差异，Mod的尿液特征与NC组相比也有显著差异。我们使用UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS进行非靶向代谢组学分析，以鉴定连续给药30天后NC和T2DM组大鼠尿液中差异表达的代谢物。主成分分析（PCA）是一种无监督的数据分析方法，用于通过观察所有样本之间的总体分布趋势并识别可能的离散点来表达T2DM大鼠的总体变化。结果表明，与NC相比，Mod的尿液发生了显著的代谢变化，大鼠SDP、Mod和NC之间存在明显的分离趋势，SDP给药组彼此靠近，相互环绕成一团，低、中、高剂量的给药组与Mod组明显分开，有远离Mod和靠近NC的趋势。

OPLS-DA用于使用偏最小二乘回归对代谢物表达与样本类别之间的关系进行建模，以实现样本类别的预测。在OPLS-DA分析方法下，2型糖尿病大鼠NC组和Mod组之间的差异更为显著，在SDP给药四周后，三个给药组彼此靠近，并围成一团，给药组与模型组明显分离，有远离Mod和接近NC的趋势，反映了不同剂量SDP对T2DM大鼠异常尿代谢谱的调节。综上所述，SDP-Hig组在两种分析模式下都更接近NC组，并且具有更好的治疗效果，这与WB、mRNA和生化指标的结果一致。以SDP-Hig和Mod之间的FC>1.5或<0.67、VIP>1.0和p<0.05为标准，我们共选择了75种尿液中的差异代谢物。SDP-Hig给药后，22种化合物被逆转，包括庚烯酸、Cortolone、癸二酸和二氢皮质酮（图15，表3）。

表3 UHPLC-QTOF/MS检测内源性代谢物的差异表达

在实验中，使用高脂肪高糖饮食结合STZ的经典建模方法，创建了一个具有“三多一少”症状和抑郁精神状态的2糖尿病大鼠模型。研究结果发现，SDP显著改善了T2DM大鼠模型的一般生活条件、FBG、Wight、OGTT、脂质四联体水平、胰岛素分泌水平和正常胰岛功能。这些指标的恢复与青蒿琥酯治疗糖尿病的效果一致，它显著降低了空腹血糖和血脂水平，从而改善了代谢紊乱。非传统的脂质参数，特别是TG和HDL-C，与2型糖尿病的风险密切相关，可能是因为TG升高会影响游离脂肪酸的增加，导致胰岛素敏感性降低和胰腺α细胞胰岛素信号的变化，增加胰岛素以提高血糖浓度。胰岛中的胆固醇沉积导致胰腺淀粉样蛋白的形成，这会损伤β细胞并破坏葡萄糖稳态。HDL可减少葡萄糖诱导的β细胞凋亡，保护β细胞功能。HDL-C水平的降低会损害β细胞功能和存活率。因此，TG/HDL-C比值被认为是胰岛素抵抗（IR）和β细胞功能障碍的潜在预测因素。这些发现得到了临床试验的进一步支持，表明高TG/HDL-C比值与糖尿病前期和2型糖尿病的风险密切相关。SDP对GHb、INS、GSH、FFA、T-AOC具有良好的作用，并改善了肝保护和抗氧化功能。FFA是T2DM发展的危险因素，与胰岛素抵抗密切相关。肌肉细胞暴露于FFA棕榈酸酯会导致胰岛素抵抗。FFA还通过增加IRS-1丝氨酸磷酸化来影响胰岛素信号通路。白藜芦醇已被证明可以恢复葡萄糖转运蛋白水平和葡萄糖摄取，激活AMPK信号通路，并抵消FFA诱导的胰岛素抵抗。SDP还能够降低大鼠的FFA水平。需要进一步的研究来确定胰岛素抵抗的降低是否是通过降低FFA表达来实现的。它还具有改善肝脏和胰腺组织形态、抑制胰岛细胞凋亡率的良好功能，在T2DM大鼠模型中具有更好的调节糖脂代谢和保护胰腺β细胞的功能，从而达到预防和治疗T2DM的目的。我们的动物实验结果表明，SDP不仅可以改善糖脂和氨基酸代谢紊乱，还可以减少T2DM大鼠的氧化应激损伤。这些效应主要通过IRS/mTOR、PI3K/AKT和甜味受体信号通路的激活来介导。

在本实验中，Mod中TRPM5、T1R2、T1R3和a-诱导蛋白表达显著降低，SDP给药后蛋白表达显著下调；这些趋势与文献中报道的趋势一致。此外，SDP低和SDP高显著提高了肠道中GLP-1蛋白的表达。我们确定，糖尿病大鼠小肠组织中甜味信号分子T1R2、T1R3、味觉信号分子、TRPM5和a-味觉信号分子的水平显著降低。这些发现表明，糖尿病大鼠小肠中的T1R2/T1R3检测到葡萄糖，并且该信号通过gustducina、TRPM5和a-gustducin传递。给糖尿病动物服用后，这些蛋白质的表达水平显著增加，表明SDP通过反向调节甜味受体水平来降低血糖水平，从而降低血糖水平。GLP-1蛋白水平的增加可能与T1R2和T1R3通过G蛋白偶联作用影响GLP-1受体有关。因此，SDP可能通过调节肠道中GLP-1和甜味受体T1R2和T1R3的表达，并影响其下游信号通路a-gustducin和TRPM5的表达，发挥间接的降血糖作用。GLP-1是一种肠胰岛素，甜味受体通过调节肠胰岛素分泌和葡萄糖摄取在葡萄糖稳态中发挥作用。甜味分子与甜味受体的结合会触发各种细胞信号的激活，如a-gustducin。

在胰岛素抵抗开始时，身体处于慢性高血糖、高脂血症和炎症状态，这导致IRS1的丝氨酸磷酸化增加，从而抑制PI3K的激活，进而降低Akt的磷酸化水平。这导致GLUT4易位减少，影响葡萄糖运输和利用，限制葡萄糖摄取，破坏胰岛素敏感性，进一步加重胰岛素抵抗症状。研究表明，Diosmetin可以通过上调IRS/PI3K信号通路来改善葡萄糖代谢，促进糖原合成并使GLUT4转化，猴头菇通过激活IRS/PI3K信号通路来促进血清葡萄糖摄取以促进肝糖原合成，从而降低胰岛素抵抗。在这项研究中，Mod组的PI3K和p-Akt水平下调，表明胰岛素信号传导缺失，而SDP可以逆转这一现象。SDP显著调节了大鼠肝脏中的PI3K和AKT水平，并显著降低了IRS-1水平，这些趋势与文献报道一致，即SDP具有剂量依赖性作用，其中SDP-Hig的效果最好。

活化的AMPK促进身体组织和肌肉对葡萄糖的摄取，从而增加血液中的葡萄糖消耗，使这些组织和肌肉更容易对胰岛素敏感，从而降低血糖并提高胰岛素利用率。活化的AMPK通路影响脂肪分解代谢和合成，以及脂肪酸分解代谢和综合，从而实现高脂肪损伤胰岛的毒性。上游信号因子LKB1激活AMPK，AMPK可以被刺激以抑制糖异生、调节细胞凋亡和增加肝糖原合成。AMPK的激活使其下游mTOR发挥抗氧化应激和抗炎作用。mTOR能够抑制PPARγ、SREBP-1和ChREBP的蛋白表达，从而引起脂肪分解，最终抑制脂肪过度升高。活化的mTORC1诱导IRS1/2丝氨酸磷酸化，从而抑制IRS1蛋白表达。一些研究报告称，桑叶提取物激活AMPK/mTOR通路，并通过保护胰岛细胞功能障碍来治疗2型糖尿病，黑桑提取物通过调节AMPK/mTOR信号通路来逆转T2DM相关的代谢异常，从而减少肝脂肪变性并改善脂质代谢紊乱。研究表明，Met可以通过间接激活AMPK来调节葡萄糖和脂质代谢，从而在治疗糖尿病方面发挥治疗作用。蛋氨酸通过激活AMPK影响脂肪酸合成和分解代谢，从而减少脂肪积累，抑制糖异生，改善胰岛素抵抗，发挥降血糖和降脂作用。最近的研究还表明，Met通过激活肠黏膜中的AMPK来刺激GLP-1的分泌，增加胰岛素的释放，并提高身体对胰岛素的敏感性。SDP在肝脏中的作用类似于Met。SDP首先激活AMPK上游蛋白LKB1，使其退化并激活AMPK的表达，随后抑制下游蛋白mTOR和S6K1的表达，这减少了肝脏中脂肪的积累，抑制了葡萄糖异构，从而改善了胰岛素抵抗，发挥了降低葡萄糖和血脂的作用。

胰岛素是葡萄糖代谢的关键调节因子，可激活IRS-1，导致胰岛素受体磷酸化。IRS-1然后通过PI3K/AKT信号通路影响糖原合酶激酶-3（GSK-3β）和mTOR通路，从而调节葡萄糖和脂质代谢以及胰岛素敏感性。越来越多的文献表明，草药可以通过调节IRS-1/PI3K/AKT信号通路来治疗2型糖尿病。Deng的研究表明，全麦青稞通过调节IRS-1/PI3K/AKT通路和miRNA、抑制肝脏糖异生和改善糖原合成来缓解小鼠的2型糖尿病症状。Zhao发现，在体外，木脂素通过激活IRS-1/PI3K/AKT途径，影响葡萄糖摄取并改善胰岛素抵抗。这也为目前五味子细胞水平治疗2型糖尿病的研究提供了理论依据。Wang发现，中药煎剂首荟通便可增强BCAAs的肠道分解代谢，调节BCAA-mTOR/IRS/PI3K/AKT轴，改善小鼠的IR和高血糖，减轻BCAAs对IRS-1信号通路的影响。他的研究与本研究相似，需要进一步调查以确定SDP是否通过增强BCAA分解代谢来调节信号通路。

最近的研究越来越强调支链氨基酸（BCAA）在糖尿病中的作用，在2型糖尿病患者中甚至在疾病发作前都可以观察到BCAA水平升高。BCAA的分解代谢通量升高可能会增强糖异生，并通过谷氨酸转氨为丙氨酸导致葡萄糖不耐受。因此，BCAA水平的升高与代谢健康状况不佳和患胰岛素抵抗（IR）或T2DM的风险较高密切相关。BCAA在体内的分解代谢分为两步，第一步是由支链氨基酸转氨酶（BCAT）催化的可逆胺化反应，产生α-酮酸（BCKA），这一过程涉及亮氨酸、异亮氨酸等。第二步是不可逆的支链酮酸脱氢酶（BCKDH）催化反应，最终产物进入三羧酸循环形成ATP。BCAA刺激胰岛素和胰高血糖素的分泌，当药物被引入体内时，它们也会在较长一段时间内增强GIP和GLP-1的分泌。在BCAA代谢过程中，脂肪酸或胰岛素水平升高会损害BCAT和BCKDH的功能，这可能进一步导致胰岛素抵抗的发展。BCAA水平升高会破坏IRS/mTOR/S6K1信号通路。BCAA激活mTOR，mTOR进而通过S6K1磷酸化丝氨酸残基上的IRS-1。IRS-1的这种磷酸化抑制AKT信号传导，减少葡萄糖转运，最终导致胰岛素抵抗。这一结论得到了另一项实验结果的支持，该实验表明，降低BCAA水平会降低mTOR信号激活，增加肝脏p-AKT表达。这些发现也与本文中的蛋白质印迹一致。因此，BCAA的积累通过激活IRS-1/mTOR通路破坏胰岛素信号传导。总之，SDP可以通过降低体内BCAA水平来改善胰岛素抵抗，BCAA水平下调PI3K/AKT通路，防止IRS-1/mTOR通路的过度激活，最终增强胰岛素敏感性。

本研究发现，SDP可能通过影响氨基酸代谢途径来调节T2DM。亮氨酸刺激细胞内信号传导，调节β细胞生长和复制，导致胰岛生长、发育。Mod大鼠亮氨酸水平的增加可能是由于胰岛素促进BCAA进入肌肉组织进行蛋白质合成，并抑制丙氨酸的肝脏摄取转化为葡萄糖，而在这些大鼠中，胰岛素分泌相对不足，导致葡萄糖和脂肪酸的氧化受阻，蛋白质水解增加，大量BCAA进入血液作为能量供应的原料，在肾脏中分解并通过尿液排泄。N-乙酰谷氨酸在2型糖尿病患者中逐渐上调，可能成为了2型糖尿病的潜在标志物。高水平的N-乙酰谷氨酸能够上调mTOR信号通路，从而导致胰岛素抵抗的发展。先前的研究表明，N-乙酰谷氨酸与糖尿病风险呈负相关。在IR损伤期间，柠檬酸循环中间体苹果酸、琥珀酸和富马酸的组织浓度增加，这与本研究中模型组苹果酸升高的结果一致，但在SDP-Hig治疗后，苹果酸水平降低，这表明SDP能够通过调节氨基酸中的苹果酸水平来影响T2DM，从而逆转了这一结果。γ-GBA相关代谢物的分解代谢紊乱可导致智力残疾、表达性失语症、运动障碍、精神疾病和癫痫。谷氨酰胺是一种重要的代谢燃料，通过满足细胞对ATP、生物合成前体和还原剂的增加需求来支持细胞的快速增殖。它通过ASCT2/SLC1A5氨基酸转运蛋白转运到细胞中，随后通过谷氨酰胺酶（GLS）催化的脱氨基反应在线粒体中转化为谷氨酸。此外，谷氨酰胺促进小肠中L细胞释放GLP-1。适当补充谷氨酰胺可以提高葡萄糖耐量。因此，2型糖尿病大鼠谷氨酸和谷氨酰胺水平的降低不利于骨骼肌力量的维持和血糖的维持等。总之，SDP-Hig可能通过调节亮氨酸、苹果酸、NAA和谷氨酸等氨基酸类似物来调节T2DM，进而影响氨基酸代谢途径，从而调节T2DM。根据本研究的讨论和发现，SDP的潜在肝保护和胰腺保护机制如图16所示。

本文采用UPLC-MS/MS和HPLC对该部位进行定性和定量分析，阐明SDP抗T2DM作用的药效物质基础。我们通过一般药效学评估分析SDP对T2DM大鼠的抗糖脂紊乱和氧化应激作用，并在T2DM大白鼠中检测胰腺中的甜味受体信号通路和肝脏中的PI3K/AKT信号通路和AMPK/mTOR。SDP通过调节尿液内源性物质的失调和调节氨基酸代谢途径，使T2DM大鼠向正常转化水平转变，从而发挥抗糖尿病作用。