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UCLA唐奕，Nature!

研之成理 · 公众号 · 科研 · 2025-01-31 08:58

正文

第一作者：Chen-Yu Chiang

通讯作者：Masao Ohashi，Yi Tang

通讯单位：美国加利福尼亚大学洛杉矶分校

DOI：

https://doi.org/10.1038/s41586-024-08362-4

背景介绍

碳氢（C−H）键基本上是每个有机分子的基础，也是化学合成的理想位点。研究的关键在于实现对某一个特定 C(sp³)−H 键的选择性修饰。近年来，科学家发现金属酶能够实现C(sp³)−H 键功能化。尽管在过去二十年中取得了很大进展，但针对未活化的 C(sp³)−H 键的酶促卤化和拟卤化反应只能通过非血红素铁/α-酮戊二酸依赖的卤化酶实现。

本文亮点

本文报告了一种此前未知的卤化酶 ApnU，它是含有未知功能结构域 3328（DUF3328）的蛋白质家族的一部分。ApnU 在其活性位点利用铜来催化多个未活化的 C(sp³)−H 键的迭代氯化。通过利用较软的铜中心，本文证明了ApnU 可以催化前所未有的酶促 C(sp³)−H 键功能化，如碘化和硫氰化。利用生化表征和蛋白质组学分析，本文确定了 ApnU 的功能寡聚状态为一个共价连接的同型二聚体，它包含三对必需的二硫键——一对链间和两对链内。电子顺磁共振光谱表明ApnU 中的金属配位活性位点由双核 II 型铜中心组成。这一发现扩展了 C(sp³)−H 卤化酶的酶促能力，并为这一类双核铜依赖性氧化酶提供了基础理解。

图文解析

图1| 一种此前未知的卤化酶的发现

要点：

1.到目前为止，非血红素铁/α-酮戊二酸依赖的卤化酶（NHFeHal）是唯一被表征出来的能够催化未活化C(sp³)–H键卤化的酶家族。在机制上类似于非血红素铁/α-酮戊二酸依赖的羟化酶，NHFeHals通过一个共识的“反弹”机制实现C(sp³)–H键的卤化，这是大多数金属酶催化的C(sp³)–H官能化反应的共同特征（图1a）。简而言之，活性位点中的铁中心在底物、卤素和氧气结合后转变为高价位卤铁物种（X–FeIV=O），该物种能够进行氢原子抽取以生成底物自由基，然后该自由基可以与顺式卤羟铁（X–FeIII–OH）上的卤素（X）反弹结合，从而生成卤化产物（R–X）（图1b）。

图2| ApnU的生化特性表征

要点：

1.使用优化条件从包涵体中重新折叠蛋白质，本文得到了可溶性的ApnU。从在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的截短ApnU（NΔ75；以下称为ApnU）开始，纯化的含有变性ApnU的包涵体在谷胱甘肽氧化还原对谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物（GSH/GSSG）和精氨酸存在下进行迭代透析。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）获得了单带纯度的可溶性蛋白（20-30 mg l^-1）。为了测定ApnU的活性，将重折叠后的无配体蛋白与1, 抗坏血酸和各种二价过渡金属包括Mn(II), Fe(II), Co(II), Ni(II), Cu(II) 和 Zn(II)孵育。液相色谱-质谱（LC-MS）分析反应显示，只有在Cu(II)存在下才能实现1的氯化（图2）。几乎有50%的1被转化为氯化产物，包括3和4，后者是主要产物，其质荷比（m/z）为400，对应于三氯化产物。还观察到少量m/z=296的5，它是1的脱氢产物。扩大反应规模后，分离出4和5用于核磁共振表征。4中的第三个氯化事件发生在3的C5'位置，导致一个双氯代季碳，并且脱氢产物5被验证含有末端烯烃。化合物4和5之前分别从Chaetasbolisia erysiophoides和Penicillium atramentosum中分离出来。总的来说，这些结果表明，据本研究团队所知，ApnU是第一个催化迭代C(sp³)-H氯化的铜依赖性卤化酶的例子。

2.与大多数使用氧气（O₂）作为氧化剂来激活C-H键的铜金属酶类似，ApnU在厌氧条件下的活性被消除（图2c）。在测定条件下，抗坏血酸是必需的还原剂，因为其他还原剂，包括二硫苏糖醇（DTT）和亚硫酸钠（Na₂S₂O₄），无法支持氯化反应（图2d）。ApnU的氯化活性在pH 6.0的MES缓冲液中达到最佳。随着NaCl浓度的增加，氯化程度（3相对于4）也增加，当NaCl浓度为50 mM时观察到最大数量的氯化事件（氯化效率）。从反应体系中完全省略NaCl会导致基于选定m/z监测产生少量的5以及非常微量的羟基化产物。然而，在无氯离子的条件下整体催化活性要低得多，这表明氯离子与铜中心的配位对于启动C(sp³)-H激活很重要。与NHFeHal催化的反应不同，在ApnU催化的反应中，去饱和生成5作为主要副反应，这是因为HO^·的反弹显著减少，这表明由于不同的金属活性位点导致了关键的机制差异。在NHFeHal催化的反应中，由于HO^·与X^·的竞争性反弹，羟基化与卤化作为副反应竞争。

图3|功能性ApnU的特征表明其为一个通过二硫键连接的同型二聚体

要点：

1.在重折叠过程中添加GSH/GSSG对是获得功能性ApnU所必需的，最佳比例为等摩尔的GSH和GSSG。虽然在没有氧化还原对的情况下可以获得可溶性蛋白，但得到的蛋白完全无活性。这表明每分子ApnU中六个半胱氨酸残基的正确氧化还原状态的重构是至关重要的。当通过阴离子交换（AEX）色谱或体积排阻色谱分析重折叠的ApnU时，检测到两个主要种类（I和II），在SDS–PAGE上均显示预期的30 kDa（图3a）。当分别纯化时，只有峰I显示出氯霉素酰基转移酶活性，而峰II无活性。对活性部分进行非还原性SDS–PAGE分析时，显示出一条大约60 kDa的主要条带，表明活性ApnU是由至少一个分子间二硫键交联的二聚体。对活性种类进行变性蛋白质量分析，通过液相色谱-四极杆飞行时间质谱（QTOF-MS）观察到的分子量为59,056 Da，这对应于ApnU二聚体的质量，并伴有12 Da的损失，这是由于二硫键形成所致（图3b）。活性ApnU的专属二聚体状态进一步通过天然蛋白质量得到证实。

2.为了确定六个半胱氨酸残基的正确配对，对ApnU进行了肽图分析（图3c、d）。样品是通过等摩尔比重折叠¹⁴N-（野生型）和¹⁵N标记的变性蛋白来制备的。活性二聚体种类通过阴离子交换色谱纯化，并进行了自下而上的蛋白质组学二硫键映射。绘制了两个分子内二硫键（C173–C200和C253–C277），以及一个分子间二硫键C210和C237'（以及C210'和C237）（图3d）。将每个半胱氨酸单独突变为丝氨酸会导致催化功能丧失，这表明所有二硫键对ApnU的活性都是必需的。这些结果与重组过程中的观察一致：（1）添加GSH/GSSG对确保了三对二硫键的正确形成，导致重折叠蛋白中出现活性酶亚群；（2）重折叠的ApnU的无活性、可溶性部分倾向于聚集成高阶寡聚体，这可能是由于单体间二硫键错配所致；（3）添加还原剂，如DTT或三(2-羧乙基)膦（TCEP），由于破坏了二硫键而完全消除了ApnU的活性（图2d）。形成链间二硫键的两个半胱氨酸残基在所有DUF3328酶中都是保守的，这表明这种独特的结构特征是该酶家族共有的。

图4| ApnU的EPR表征及提出的卤化机制

要点：

1.为了更深入地了解ApnU中的铜中心，通过电子顺磁共振（EPR）光谱分析了无His₆标签的ApnU。在加入过量Cu(II)进行金属化并通过脱盐或透析进行样品清洁后，加载Cu(II)的ApnU的EPR光谱显示出一种II型Cu(II)信号，每个活性位点附近有两个铜原子的自旋定量（图4a）。在厌氧条件下加入过量抗坏血酸后，Cu(II)的EPR信号消失，这证实了抗坏血酸在将Cu(II)还原为Cu(I)以启动与氧气激活相关的催化循环中的作用。

2.结合实验结果、双核铜酶的已知机制以及密度泛函理论计算，可以提出ApnU催化卤化的一种可能机制（图4b）。完整ApnU的静息状态包含两个非耦合的Cu(II)中心，它们可以被抗坏血酸还原为Cu(I)，随后通过O₂激活生成过氧桥连的双核中间体INT1（μ-η²:η²-过氧桥）Cu(II)Cu(II)。阴离子与铜中心配位形成中间体INT2后，从抗坏血酸中提取氢原子形成中间体INT3（μ‐O·)(μ‐OH)Cu(II)Cu(II)。这是从底物1中提取氢的反应物，其计算的活化能垒（ΔG‡）为4.4 kcal/mol。与铜中心配位的卤素与底物自由基反弹（ΔG‡ = 4.1 kcal/mol）生成卤化产物，并伴随其中一个Cu(II)中心的还原。另一个Cu(II)中心被抗坏血酸还原，重新启动催化循环。

总结与展望

本文发现并鉴定了一种此前未知的卤化酶 ApnU，它属于庞大的真菌蛋白 DUF3328 家族。ApnU 催化了对天然底物 atpenin B（1）中多个 C(sp³)–H 键的铜依赖性、迭代式氯化。ApnU 含有在其他 DUF3328 蛋白中发现的双重 HXXHC 基序，据 EPR 和 ICP–MS 揭示，这些基序可能与两个 Cu(II)金属离子形成金属结合位点。ApnU 中的铜中心使其能够实现铁基卤化酶无法达成的 C(sp³)–H 功能化。尽管已报道黄素依赖性卤化酶可催化区域选择性 C(sp2)–H 碘化，但 ApnU 除了能催化硫氰化和硒氰化外，还能催化区域选择性 C(sp³)–H 碘化。虽然铁依赖性酶在催化效能上无与伦比且高度可进化（如通过对非血红素铁依赖性酶进行工程改造来构建自由基氟转移酶），但本文发现的铜依赖性酶从根本上改变了酶促 C(sp³)–H 功能化反应的范围。本工作为研究这个庞大但本质上未被探索的 DUF3328 金属酶家族提供了蓝图，以发现新的酶功能。

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