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Plus深读 | 5-甲基胞嘧啶通过稳定mRNAs调控实体瘤膀胱癌发生机制

23Plus · 公众号 · 生物 · 2019-08-14 07:00

正文

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41556-019-0361-y

RNA修饰，如N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A），已被证明在生理和/或病理条件下调节多种细胞功能 ¹ 。5-甲基胞嘧啶(m ⁵ C)也被报道参与RNA代谢调控。特别是，m ⁵ C不仅在核糖体RNA和转移RNA中被检测到，而且在信使RNA中也通过基于高通量测序的转录组范围的作图方法被检测到 ^2-8 。据报道，mRNA中的m ⁵ C修饰是由NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2 (NSUN2) ^2-4 ^，6-8 催化的，在mRNA的翻译起始位点附近、3’UTRs和Argonaute结合区域附近有明显的富集 ^2,5,8 。在病理条件下，特别是在人实体肿瘤中，对m ⁵ C等RNA修饰的分子动力学和/或功能仍缺乏详细的研究。

人类膀胱尿路上皮癌(UCB)，包括两大类临床病理类型的非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC);pTa/1)和肌肉浸润性膀胱癌(MIBC，pT2–pT4) ¹⁰ ，提供了一个理想的模型系统来研究肿瘤发生和/或肿瘤进展的多阶段特征。在这项研究中，我们提供了人类UCBs中mRNA m ⁵ C修饰的单核苷酸解析图，并揭示NSUN2和Y-box结合蛋白1（YBX1）作为m ⁵ C的特定“作者”和“读者”，分别通过靶向其3’UTR上的m ⁵ c修饰位点，稳定肝素结合生长因子(HDGF)的癌基因mRNA，从而在UCB中发挥重要的致癌作用。因此，我们的研究结果阐明了RNA m ⁵ c介导的癌基因激活在UCB发病机制中的调控机制，并为靶向UCB中的NSUN2/YBX1/m5C-HDGF信号轴提供了治疗理论依据。

一

研究结果

1.RNA m5C 在UCB组织中的分布

为了在UCBs中绘制单碱基分辨率下的转录组m ⁵ C修饰图，我们对36个UCB和29个邻近正常组织(包括22对癌变和非癌变膀胱组织)进行了改进的RNA亚硫酸氢盐测序(RNA- BisSeq)方法。我们发现，大多数m ⁵ C位点(约为 90%)存在于mRNA中，并且在在每个样本的2,281-8,957个mRNA中识别出7,204-115,867个m ⁵ C位点。

每个样品中m ⁵ C位点的甲基化中值在0.15 ~ 0.23之间。m ⁵ C位点在编码序列和3’UTRs中富集，有趣的是似乎在翻译起始位点下游的编码序列区域富集。序列频率logo显示了在GC丰富的区域中嵌入m ⁵ C位点的特征。这些发现与以前关于HeLa细胞和小鼠组织的报道一致 ^5，8 ，这表明这些特征不仅在不同物种中高度保守，而且在人类正常组织和肿瘤组织中也高度保守。

2. m ⁵ C 在UCBs中经常高甲基化，并在致癌途径中富集

我们的RNA-BisSeq数据显示，5280个m ⁵ C位点的甲基化水平在肿瘤和正常组织之间存在显著差异。其中，2041个mRNA中有4,126个m ⁵ C位点高甲基化，504个mRNA中有1,154个m ⁵ C位点在UCBs中相对于正常对照组显示低甲基化，表明m ⁵ C位点在UCBs中经常高甲基化。与此相一致的是，对5对配对肿瘤和邻近正常组织的超高效液相色谱-三重四极质谱联用多重反应监测(UHPLC-MRM-MS /MS)分析显示，肿瘤样本中整体mRNA m ⁵ C含量增加。

UCB中频繁发生的m5C高甲基化使我们明确了m ⁵ C高甲基化mRNA的功能。利用独创性途径分析(IPA)的功能富集分析表明，高甲基化mRNA主要富集于十个典型的癌症相关途径。基于IPA和之前报道的研究结果 ^11-13 ，这些通路中有6个(JAK-STAT、ERBB、PI3K-AKT、VEGF、上皮细胞向间质转化(EMT)和ERK-MAPK)中的103个基因在肿瘤中甲基化倾向增加。图1a显示了50个代表性基因的热图，其中12个基因在肿瘤中甲基化增加最多(每个途径1-3个)(图1b)。相比之下，m ⁵ c -低甲基化基因主要富集于线粒体功能和免疫应答相关通路。综上所述，m ⁵ C高甲基化在UCBs中是一个频繁的事件，高甲基化mRNA在致癌通路中富集。

图1：UCBs中的RNA m ⁵ C高甲基化图

3. m ⁵ C 高甲基化与UCBs中癌基因mRNA过表达有关

为了研究m ⁵ C修饰与基因表达的关系，我们对同一队列36个UCBs和29个邻近正常组织进行了RNA测序(RNA- seq)，并在UCBs中识别出m ⁵ C位点高甲基化的差异表达mRNA(600个上调，244个下调)(图2a)。有趣的是，几个致癌基因，即HDGF、F11受体(F11R) ²¹ 、RAB11家族相互作用蛋白4 (RAB11FIP4) ²² 和MLLT11 (ref. ²³ ), 在UCBs中均表现出m ⁵ C高甲基化和mRNA上调(如图2b中的HDGF)，并在检测的UCBs中表现出显著相关性(图2c)。这种强相关性在22对UCB和正常组织中得到进一步验证(图2d,e)。Kaplan-Meier对癌症基因组图谱(TCGA) UCB队列中这些癌基因的分析显示，它们的高表达水平与无病生存(DFS)降低之间存在正相关;图2f)。此外，在中山大学癌症中心(SYSUCC)的UCB队列中，上述致癌基因的m ⁵ C水平与NSUN2表达呈正相关。这些数据表明，m ⁵ C对mRNA的修饰可以增强与UCB进展相关的某些癌基因mRNA表达。

图2：m ⁵ C高甲基化与mRNA表达呈正相关

4. YBX1 是m ⁵ C阅读器

m ⁶ A已被证明通过其读码器YTHDF2促进mRNA的衰减(参考文献 ²⁴ )。因此，可以假设m ⁵ C修饰通过其在UCBs中的读卡器调控基因表达。ALYREF被报道为核m ⁵ C阅读器，主要介导mRNA的输出。由于mRNA代谢的复杂性，额外的m ⁵ C reader(s)可能参与了mRNA的调控。我们采用oligo下拉实验结合液相色谱-串联质谱分析，寻找其他m ⁵ C阅读器(PeptideAtlas登录号:PASS01231)，确定YBX1为潜在的细胞质m ⁵ C阅读器(图3a)。YBX1是一种多功能蛋白，主要定位于细胞质中 ²⁵ 。体外蛋白下拉和电泳-移动-转移实验证实YBX1 ²⁶ 重组蛋白较好地与m5C修饰的寡核苷酸结合(图3b,c)，为YBX1是m5C阅读器的观点提供了支持。人YBX1的冷休克区(CSD)负责以序列依赖的方式识别RNA (CA(U/C)C motif) ²⁷ 。等温滴定量热法(ITC)测定 ²⁸ 表明，YBX1 CSD(残基48-159)与改性的具有解离常数的RNA寡核苷酸(5 ' -UCAU(m5C)U-3 ')(KD为) 0.9±0.2μM的m ⁵ c结合，而未甲基化的RNA寡核苷酸（5'-UCAUCU-3'）的结合亲和力低3.7倍（KD = 3.3±0.5μM;图3d），表明YBX1 CSD优先结合m ⁵ C- 修饰的RNA寡核苷酸。与m ⁶ A的结合方式相反，其阅读器仅显示m ⁶ A修饰的核苷酸结合 ²⁹ ，YBX1与m5C修饰的寡核苷酸相比具有更高的结合偏好，尽管它能够与m5C修饰和未修饰的RNA寡核苷酸结合。

然后进行结晶实验，探索YBX1识别m ⁵ C的分子基础。测定了人YBX1 CSD(残基50-130)与含m ⁵ c RNA六聚体寡聚物复合物的1.8 A结构。YBX1 CSD与经典的寡核苷酸/寡糖结合折叠通过广泛的蛋白- RNA接触与RNA相互作用(图3e)。类似于Lin28 CSD和RNA复合物结构 ³⁰ ，中心四个核苷酸通过π-π相互作用堆积超过四个保守的芳香族残基，即C2上的H87，A3上的F85，U4上的F74和m5C5上的W65（图3f）。有趣的是，我们观察到YBX1和m5C5核苷酸之间的其他一些相互作用，如N67和N70的侧链分别与m5C5的O2和2 ' -羟基形成直接氢键(图3g)。然而，m ⁵ C ₅ 的甲基堆叠在W65的侧链上，提供更多的疏水区域以与W65的吲哚环形成CH-π相互作用而不是未甲基化的胞嘧啶碱基。

YBX1突变(W65F)与减毒CH-π交互生成以定义W65在m5C5识别中的重要性（图 3b）。我们测试了NSUN2调控的YBX1 rna结合亲和力，发现NSUN2敲除后HeLa和T24细胞中YBX1 rna结合亲和力显著下降(图3i-l)。具体来说，WT可以显著逆转这种效应，但m ⁵ c -甲基转移酶缺陷的NSUN2不能(图3m)。

图3：YBX1是一个特定的m ⁵ C阅读器

5. YBX1 与mRNA稳定性维持者ELAVL1相互作用

为了探索YBX1如何介导mRNA代谢，我们进行了筛选人T24细胞中的YBX1相互作用配偶体（PeptideAtlas登录号：PASS01230;图4a）并鉴定出ELAVL1作为推定的YBX1配偶体。通过共免疫沉淀法进一步证实了它们之间的相互作用(图4b)。有趣的是，在NSUN2或YBX1敲除后，ELAVL1的rna结合能力显著下降(图4c,d)。此外，通过重建WT而不是m5C结合缺陷型YBX1（图4e，f），可以显著恢复由YBX1消耗调节的作用。然后我们分析了他们的PAR-CLIP-Seq数据，发现他们的结合mRNA目标之间78%(6,628个中的5,199个)重叠，而且他们的结合区域之间的空间距离更近(图4g、h和补充表5)。在4,476个含有m5c的mRNA中，49%(4,476个中的2,208个)被YBX1和ELAVL1结合。总的来说，我们的数据提供了明确的证据，表明YBX1与m5c修饰的mRNA结合，并通过直接招募ELAVL1来调节其稳定性。

图4：YBX1通过招募ELAVL1调控mRNA的稳定性

6. NSUN2 和YBX1在UCB中高度表达

接下来，我们研究了8个ucb (SYSUCC)中NSUN2和YBX1的表达，发现这两种蛋白在这些肿瘤中经常上调(图5a)。免疫组化(IHC)对199例UCBs和50例来自SYSUCC的匹配的非癌性膀胱组织进行了大样本染色，结果显示，相对于非癌性对照，在199个中的117个（58.79％）和199个中的106个（53.27％）UCB中分别观察到NSUN2和YBX1的高表达（图5b，c）。UCB中NSUN2或YBX1的高表达与晚期T和N分期和肿瘤分级（P <0.05）和UCB患者的差DFS（P <0.05;图5d，e）呈正相关。这些结果证明NUSN2或YBX1的上调是人类UCBs中常见的致癌事件。

图5：SYSUCC组UCB患者中NSUN2和YBX1过表达与预后不良相关

7. NSUN2 和YBX1通过调节m ⁵ C在UCB中发挥致癌作用

使用Balb/c裸鼠原位异位移植物膀胱模型1l，我们发现NSUN2-或ybx1 -缺失的T24细胞植入小鼠膀胱，与植入向量控制细胞的膀胱中较大的肌肉浸润性病变相比，粘膜下病变较小(图6a、b)。重要的是，使用患者衍生的异种移植(PDX)皮下肿瘤模型，我们证明NSUN2或YBX1基因的下调可以显著抑制体内皮下肿瘤的生长(图6c)。

图6：NSUN2和YBX1促进UCB发病机制

8. 由NSUN2和YBX1调节HDGF在UCBs中依赖于m ⁵ C

在T24细胞的全转录组RNA-BisSeq和RNA-Seq分析中，NSUN2沉默后，604个mRNA的m5C甲基化和mRNA表达均显著降低，其中394个mRNA直接与YBX1结合(图7a)。有趣的是，HDGF的3 ' UTR中含有一个m5C位点，与YBX1和ELAVL1的结合位点吻合良好(图7b)。来自SYSUCC UCB队列的RNA-BisSeq和RNA-Seq数据集的分析进一步支持了这些发现，表明HDGF的m5C甲基化水平与NSUN2和YBX1表达呈正相关（图7c）。

9.HDGF 在m5c依赖的机制中促进UCB发病

我们进一步证明含有HDGF的m5C位点在功能上模拟了NSUN2和YBX1在UCBs中的致癌功能，研究结果表明，与NSUN2/YBX1耗竭相似，HDGF下调显著抑制UCB细胞生长，这可以通过WT过表达而不是突变m5C位点的HDGF来恢复(图7d)。UCB PDX模型的结果证明了这一点 HDGF敲低可明显抑制两例UCB患者PDX肿瘤的皮下生长(图7e)。此外，对SYSUCC UCB队列中HDGF的临床相关性分析显示，HDGF在199(50.25%)个UCB组织中均有高表达(图7f)。进一步相关分析显示HDGF高表达与晚期T、N分期及肿瘤分级呈正相关(P < 0.05)，与UCBs中YBX1水平显著相关(图7f)。此外，生存分析表明，这三个基因的高表达预测了最差的DFS(图7f)。这些发现支持HDGF在UCB中的致癌作用。

更重要的是，TCGA泛癌基因调控分析发现了HDGF和YBX1在6种不同实体肿瘤中的表达水平间显著的相关性。此外，NSUN2、YBX1和HDGF的高表达联合预测了最差的DFS，提示NSUN2 - YBX1-HDGF调节轴是肿瘤发病机制的一个真正的信号通路，对多种类型的人类实体肿瘤的发病机制和患者预后至关重要。

图7：NSUN2和YBX1以m5C依赖的方式促进HDGF mRNA的稳定性并最终促进膀胱癌肿瘤的发病机制

二

小结

基因组研究揭示了驱动UCB发病机制的关键基因突变，如大多数NMIBC31病例中的FGFR3激活，以及包括TSC1和CDH1在内的肿瘤抑制基因的频繁失活 ^32,33 。最近的一项研究发现，有58个基因——包括KMT2C、ATM和fat1——在MIBC中发生了显著的突变，总体突变负荷与APOBEC -signature突变有关 ¹⁰ 。此外，包括异常DNA甲基化和组蛋白修饰在内的表观遗传机制也参与了UCB的发育 ^14,34 。RNA m ⁶ A修饰的失调通过调节癌基因表达在人类癌症中发挥着不同的作用。在此，我们提供了人类UCB中单碱基分辨率RNA m5C的图谱，并证明RNA m ⁵ C高甲基化是UCB中致癌基因激活的另一个分子事件，这得到了以下证据的有力支持:（1）m ⁵ C mRNA的高甲基化在癌症相关通路中高度富集，如PI3K-AKT35和ERK-MAPK36，与正常组织相比，许多癌基因，如HDGF，在UCB组织中经常发生m ⁵ C高甲基化，并且在肿瘤从NMIBC进展到MIBC过程中显著上调；（2）m ⁵ C writer NSUN2和m ⁵ C reader YBX1在UCBs中异常升高，从而通过增强HDGF mRNA在m ⁵ C位点依赖机制中的稳定性，促进UCB的发病机制；（3）除UCB外，其他类型的实体肿瘤HDGF与YBX1表达均有显著相关性。此外，在UCB和其他实体肿瘤中，NSUN2、YBX1和HDGF这三种蛋白的高表达预测了最低的存活率。综上所述，这些结果表明RNA m ⁵ C高甲基化代表了包括UCB在内的人类肿瘤中癌基因激活的一种机制，并可能作为一种有价值的预后生物标志物来区分晚期和/或生存期较差的UCB患者。

RNA修饰的调控作用通常由它们的受体蛋白来解释。到目前为止，核ALYREF是唯一已知的识别m5C修饰mRNA并促进其输出的m ⁵ C结合蛋白 ⁸ 。通过晶体结构分析和体外RNA -蛋白相互作用实验，我们发现细胞质YBX1是一个m ⁵ C阅读器，优先通过CSD中W65的吲哚环识别m ⁵ C修饰的mRNA。YBX1与m ⁵ c修饰RNA结合的方式与YTH家族成员与m ⁶ A结合的方式不同，只有m6A修饰RNA才能与YTH域 ²⁹ 结合(补充图3c)。有趣的是，YBX1 m ⁵ C结合模式类似于DNA 5mC识别的一些转录因子，如MBD4（参考文献 ³⁷ ）和Klf4（参考文献 ³⁸ ;补充图3d，e），它们同时与未修饰和5mc修饰的DNA结合，但更倾向于后者。在它们的结构中，5mC与精氨酸残基和脱氧鸟苷形成三联结构, 其中5mC的甲基通过Van de Waals相互作用与胍基部分接触。此外，我们发现YBX1与其靶rna的结合亲和力依赖于NSUN2的甲基转移酶活性。YBX1的CSD是维持哺乳动物mRNA稳定性的关键区域。为支持这一点，我们发现YBX1与ELAVL1相互作用，已知的mRNA稳定性维持者，并通过其W65氨基酸调控ELAVL1的RNA结合亲和力。因此，我们的结果表明YBX1通过招募ELAVL1维持其结合的含m ⁵ c rna的稳定性的机制。

来自tRNA的片段被证明与YBX1有关，这与应激反应和乳腺癌进展有关 ^41，42 。HDGF是肺癌 ⁴³ 、胰腺癌 ⁴⁴ 和乳腺癌 ⁴⁵ 中著名的致癌基因，与侵袭性疾病呈正相关。在此，我们确定HDGF是UCB进展过程中NSUN2和YBX1的重要靶点之一，并揭示了一个m ⁵ c修饰依赖的机制，对UCB中HDGF的激活至关重要。总的来说，我们提出了主要分子的工作模型机制，即NSUN2 / YBX1 / m5C-HDGF信号传导轴，促进UCB的发病机制。我们的发现进一步提示了有效的预后生物标志物并强调对UCB进行表位靶向治疗的机会。

三

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32.

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