南京医科大学一区（IF 7.9）：单细胞分析结合湿实验，怪不得发一区轻轻松松？

当单细胞分析结合实验的时候， 不仅仅能够提供足够的思路与提示，能够将疾病背后可能的通路揭示出来，更可以揭开线粒体自噬背后可能的表观修饰 。

今天就通过这篇来自南京医科大学的干湿结合文章，带大家领略一下，单细胞分析如何能够为一篇文章起到如虎添翼的作用，并将这篇文章一举送入 J CR 1 区 CLINICAL AND TRANSLATIONAL MEDICINE （ IF 7.9 ）的行列。

文章标题： Rictor/mTORC2 signalling contributes to renal vascular endothelial-to-mesenchymal transition and renal allograft interstitial fibrosis by regulating BNIP3-mediated mitophagy

本文揭示了 Rictor/mTORC2 信号通路 （ 具体机制 ） 在肾移植后慢性移植肾功能障碍（ CAD ）的发病机制中的作用，特别是其如何通过调节 BNIP3 介导的线粒体自噬 （ 细胞层面 ） 影响肾血管内皮 - 间质转化（ EndMT ）和肾移植间质纤维化 （ 疾病表型 ） 。

研究发现 Rictor/mTORC2 信号通路的激活与 CAD 患者肾移植组织中的 EndMT 和纤维化有关，而抑制该信号通路能够减轻 EndMT 并改善移植肾纤维化 （ 文章亮点1 ） 。此外，研究还发现 Rictor/mTORC2 信号通路通过促进 MARCH5 介导的 BNIP3 蛋白 K48 链接泛素化，从而调节线粒体自噬活性 （ 文章亮点2 ）。

1 、作者是如何确定 Rictor/mTORC2 信号通路 的？

背景调研： 现有研究表明， mTOR （哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）信号通路在调节细胞生长、增殖、代谢以及纤维化等生物学过程中的作用 ，且 mTORC1 和 mTORC2 两个不同的复合体在不同病理过程中 对肾脏疾病有潜在影响。

数据库分析： 通过对公开数据库中的单细胞转录组数据进行分析 ，识别了在 CAD 患者中与健康组织相比表达差异的基因。 Rictor 作为 mTORC2 的一个关键组成部分，在数据分析中显示出表达水平的显著变化。

2 、作者如何将 Rictor/mTORC2 信号通路与 EndMT 联系起来的，又是如何验证的 ？

提出假设 ： 基于 mTORC2 信号通路已知的在细胞增殖、迁移和分化中的作用，作者提出了一个假设： Rictor/mTORC2 信号通路可能在 EndMT 中发挥作用，进而影响肾移植后的纤维化过程。

实验验证 ： 在体外细胞模型（如 HUVECs ）中，作者通过 siRNA 或 CRISPR/Cas9 技术敲除或敲低 Rictor 的表达，然后通过 TNFα 等诱导剂模拟 EndMT 的微环境，观察 Rictor 缺失对 EndMT 的影响。 同时通过检测 EndMT 过程中关键细胞标志物的变化（如 CD31 的减少和 FN 、 Collagen I 、 αSMA 的增加） 评估了 Rictor/mTORC2 信号通路对 EndMT 的影响 。

3 、进一步的作者为什么又联系到了线粒体自噬？又是如何进行验证的？

提出假设 ：在单细胞转录组分析中，发现了与线粒体自噬相关的基因表达变化 ，这提示了线粒体自噬可能在肾移植纤维化中起作用，再加上线粒体自噬是细胞清除损伤或功能失常的线粒体的过程，这对于维持细胞健康和防止纤维化很重要。作者推测 Rictor/mTORC2 信号通路可能通过影响线粒体自噬来参与调控 EndMT 。

实验验证 ： 通过敲除或抑制 Rictor 表达后，观察到线粒体自噬标志物（如 BNIP3 和 LC3 ）的表达变化， 并通过 Western blot 、免疫沉淀和泛素化实验，探索了 Rictor/mTORC2 信号通路如何影响线粒体自噬相关蛋白的稳定性和活性。 接着，通过 siRNA 或 shRNA 技术敲低 BNIP3 的表达，进一步研究了 BNIP3 在线粒体自噬和 EndMT 中的功能。

4 、如何发现泛素化调控？又是如何验证的？

提出假设 ：在单细胞分析中，发现了与泛素化途径相关的基因表达变化 ，这提示了泛素化可能在线粒体自噬和 EndMT 中起作用。

实验 验证 ： 随后作者通过免疫沉淀和 W B ，作者检测了 BNIP3 蛋白的泛素化水平。在 Rictor 敲除或过表达的细胞中，使用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理，观察到 BNIP3 泛素化水平的变化。 利用点突变技术，作者构建了 BNIP3 蛋白的突变体，替换了预测的泛素化位点上的赖氨酸残基，然后通过泛素化实验来验证这些位点是否是 Rictor/mTORC2 信号通路调控的关键位点 ，并通过敲低或过表达特定的 E3 泛素连接酶（如 MARCH5 ），作者验证了这些酶对 BNIP3 泛素化和蛋白稳定性的影响。

解释 C AD 发病新机制： 研究发现 Rictor/mTORC2 信号通路在 CAD 患者的肾血管内皮细胞中激活，并可能促进肾血管内皮 - 间质转化（ EndMT ）和肾移植间质纤维化。

线粒体自噬调控机制的新发现： 文章揭示了 Rictor/mTORC2 信号通路通过调节 BNIP3 蛋白的稳定性和泛素化，进而影响线粒体自噬活性。特别是， Rictor/mTORC2 信号通路促进了 BNIP3 在特定赖氨酸位点（ K130 ）上的 K48 链接泛素化，导致其蛋白酶体降解 。

基于本文的研究基础， 对 Rictor/mTORC2 信号通路如何精确调控 BNIP3 介导的线粒体自噬这一过程进行，可以做更详尽的探索 ，比如这样设计是个好主意：

挖掘 BNIP3 的调控网络 ： 通过 对 DNA 序列的分析，以识别转录因子结合位点 ，研究特定转录因子如何通过结合 BNIP3 基因的启动子区域来调控其转录 ，并 利用免疫共沉淀和质谱分析等技术，研究 BNIP3 与哪些蛋白相互作用，形成复合体，以及这些相互作用如何影响线粒体自噬。

探索泛素 - 蛋白酶体系统的交互作用： 利用质谱技术鉴定 BNIP3 蛋白上的特定赖氨酸残基，这些位点被泛素化，导致蛋白酶体降解 ，探索去泛素化酶如何移除 BNIP3 上的泛素化修饰，从而调节其稳定性和线粒体自噬活性。