Nature子刊| 作者自述轻松一次克隆上万基因【生物极客特评】

生物极客导读 ：

DNA测序创造了前所未有的丰富的生物信息。随着并行化的进步，“阅读”DNA序列现已成为比“写” （例如，合成或克隆感兴趣的序列）他们更有效率和具有更低成本效益。因此，我们的DNA序列的日益扩增与我们对功能意义的理解之间形成了瓶颈。因此，需要能够合成和克隆长DNA序列的大规模并行技术来弥补从序列到功能的距离。

长目标序列的高度多重克隆 以前没有被证实。如果简单的使用PCR进行扩增，由于引物之间的复杂关系，极容易导致失败，而且由于克隆的限制性内切，导致该技术不能用于大批量的克隆。

那么如何解决大批量扩增的过程？

科学家们非常传奇的想到，分子反转探针（MIP），这是一个什么东西那？

如上图，MIPs是短单链DNA（ssDNA）分子（ 〜 150bp ），其在退火之后与期望的DNA片段侧翼的靶序列匹配，然后间隙填充而变圆，到达。然而，由于双链（dsDNA）的持续长度（“刚性”），传统的MIP在捕获更大的靶序列（大于 〜 200bp ）方面是低效的。

这个约束已经阻止了它们用于捕获较大片段和克隆编码全长蛋白质或大蛋白质结构域的开放阅读框（ORF）。为了解决这个目标大小的限制，增加MIP连接器主干的长度已被证明允许捕获更长的目标（高达 〜 400bp ）。然而，用于构建这些探针的方法需要针对每个单独的探针进行单独的PCR反应，从而限制其可扩展性。此外，这些长的MIP被构建为dsDNA探针，导致捕获有义和反义DNA链，这对于某些应用无法实现，例如从基因组DNA克隆ORF。

因此科学家们开发了一些新的PCR方法，引入长度很大间隔区域，从而可以很容易的进行几KB的PCR，并且利用这项技术实现了大肠杆菌全基因组的克隆。

撰文 Lorenzo Tosi

作者自述：

不管你信不信，现在我躺在意大利里维埃拉的床上，边吃着早餐，边与我的妻子和我的新生女儿一起享受天气和大海，但根本无法忘记我不得不回去做研究和在科学上真正做一些有意义的事情。

我的博士专注在在食品微生物学领域，所以我开始嘲笑我的大脑，将我的背景应用于生物医学研究。最初的时候，我和本·拉曼博士进行联络，后来他成为了我博士的导师，目前他在一家意大利创业公司工作，这个公司最初是从麻省理工学院分离出去的。从06年到08年，Ben和我研究了通过原位链复制过程“复制”DNA微阵列的方法，然后通过冲压将新的链转移到新的表面。后来 Ben把我介绍给他以前的同学哈佛医学院的Biju Parekkadan博士。 Biju是鉴定具有治疗活性的生物分子的专家，我力荐他微生物基因组是未开发潜力的丰富来源。所以我最终前往了Biju那里。

在他实验室开始不久的一天，Biju打电话给我，让我进入他的办公室，与Ben一起进行头脑风暴，Ben当时候还在 San Diego 。我们认为使用传统方法制作蛋白质文库将花费太多费时费力。在谈话期间，我们决定重新设计分子反转探针（MIP）技术，使得能够从基因组DNA靶向克隆完整的开放阅读框架（ORF）。

MIP