单克隆抗体（mAb）片段化是一个普遍存在的蛋白质稳定性问题，在生产工艺开发过程中需要仔细监测以进行关键的mAb质量控制。
本研究在这里描述了CHO宿主细胞蛋白酶在早期生产过程的制剂样品中诱导治疗性mAb-X片段化的发现和特征。在高温下孵育的mAb-X制剂样品的十二烷基硫酸钠毛细管电泳（CE-SDS）分析中观察到断裂。使用尺寸排阻液相色谱（SEC-HPLC）分析和收集这些来自mAb-X的裂解片段。反相液相色谱质谱（RP-LC-MS）和串联质谱（MS/MS）分析表明，该片段主要是由于mAb-X铰链区裂解而产生的。使用CE-SDS和SDS-PAGE分析在pH 4.0至6.0的mAb-X制剂样品中表征了裂解率。在40°C下，pH值从6.0降至4.0，持续28天，主片段的百分比从2.8%急剧增加到31.2%，这表明片段高度依赖于pH值。SDS-PAGE分析进一步验证了mAb-X骨架的pH依赖性。此外，在存在和不存在酸性蛋白酶抑制剂pepstatin A的情况下，对断裂进行了表征。在mAb-X制剂样品中加入pepstatin A后，观察到mAb-X裂解的显著抑制。这些结果表明，早期生产过程中制剂样品中残留的酸性宿主细胞蛋白酶导致了mAb-X的裂解。为了证明这一点，我们开发了一种优化的蛋白A色谱法，以提高mAb X纯化过程中残留的宿主细胞蛋白酶的去除能力，从而消除上述mAb-X裂解片段，这进一步支持了这样一种假设，即mAb-X断裂是由早期生产过程制剂样品中的残留宿主细胞蛋白酶催化的。该案例研究重申，残留宿主细胞蛋白酶是一种关键质量属性（CQA），应仔细控制和评估，以确保单克隆抗体产品的成功制造过程。
基于单克隆抗体的疗法已被开发为治疗各种疾病的重要生物制药药物，包括自身免疫性疾病、血液系统恶性肿瘤、实体瘤和炎症等。稳定性是单克隆抗体产品的关键质量属性（CQA），需要对其进行全面研究和监测，以确保其有效性和安全性。
单克隆抗体的不稳定性可能是由各种化学、物理和生物因素引起的，如制剂缓冲液成分、pH值、光照、温度、残留杂质和污染物，所有这些因素都给生物制药行业带来了巨大的挑战。
治疗性单克隆抗体的裂解是一种常见的降解途径，在整个储存和运输过程中会影响药物产品最终的质量。此外，单克隆抗体产品的裂解模式重新呈现了与指纹产品
（finger-print products）
相关的杂质分布，对于评估制造过程和产品稳定性的一致性以及不同时间和地点生产的产品的可比性至关重要。裂解的降解途径涉及肽键水解，将抗体解离成几个片段，如Fab、Fc、F（ab′）2甚至更小的多肽。为了生产更稳定的产品并开发更高效的生产工艺，已经发表了许多研究，重点是更好地理解和控制裂解的降解途径。由于铰链区具有高度柔性和溶剂暴露的特性，它通常是单克隆抗体发生断裂的最常见位置。Vlasak等人总结了单克隆抗体铰链区的物理化学裂解，这通常受到制剂pH值、储存温度、构象结构和特殊金属离子的显著影响。此外，还报道了单克隆抗体恒定免疫球蛋白结构域中的几个肽切割位点，但考虑到片段产物丰度低的事实，这些片段化似乎不太重要。除了铰链区和恒定结构域的断裂外，还有案例研究表明，单克隆抗体可变结构域中的肽键水解率很高。Bondarenko及其同事在高温弱酸性缓冲液中鉴定出重组单克隆抗体互补决定区（CDR）中Asp-Asp基序的片段。同样，我们之前采用了综合分析方法的组合，以最终确定重组单克隆抗体重链CDR区Ser-Ser肽键切割产生的片段的身份。
基因工程改造的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞被广泛用作生产治疗抗体的宿主表达系统，主要是因为产生人类相容糖基化模式的蛋白质的特性。去除宿主细胞蛋白（HCP）杂质是表达mAb的CHO细胞的主要发育挑战。监管机构已经提供了一般指南，说明必须将HCP不纯度的潜在风险（包括免疫原性、佐剂活性和蛋白水解活性）降至安全水平。在治疗性单克隆抗体的纯化中，通常预期蛋白A亲和层析结合一个或两个其他后续正交精纯步骤将HCP降低到可接受的水平。然而，某些HCP可能会与产品或色谱树脂结合，并通过分子间相互作用共同洗脱。共洗脱HCP可能难以在整个纯化过程中去除，从而以影响产品稳定性的水平存在于最终的mAb药物产品中。正如ICH Q5E指南中强调的那样，微量蛋白酶的存在可能只能通过在较长一段稳定时间内发生的产品降解来检测。也有报道称，具有蛋白水解活性的残留HCP会显著影响治疗性生物候选物的稳定性。然而，案例研究的数量仍在进一步增加，表明当活性残留前体影响单克隆抗体产品的稳定性时，纯化过程会得到彻底优化，以确保有效去除宿主细胞前体，从而更好地控制这些重要生物产品的质量和稳定性。
在这里，我们首先发现并表征了在早期纯化和制剂过程开发过程中CHO细胞中表达的治疗性IgG4 mAb-X的片段化，这归因于残留的CHO宿主细胞蛋白酶的催化功能。然后，我们开发了一种优化的蛋白A色谱纯化工艺，以彻底去除活性蛋白酶，确保mAb-X的产品稳定性。该案例研究表明，在纯化过程中有效去除工艺相关杂质对保证治疗性mAb产品的稳定性和疗效起着至关重要的作用。
CE-SDS和SEC-HPLC对mAb-X片段的分析
CE-SDS已被广泛用作治疗性单克隆抗体纯度和片段杂质分析的重要表征和释放分析方法。在本研究中，在40°C应力条件下储存28天的mAb-X制剂样品（强制降解样品）的非还原CE-SDS分析中观察到一个特定片段（片段-1）。如图1A所示，观察到片段-1在25分钟时在强制降解样品的电泳图中洗脱，但在对照样品（储存在4°C下）的电泳图上没有洗脱。CE-SDS根据蛋白质的动态大小检测蛋白质，在强制降级样品中观察到的片段-1的大小位于mAb-X的HL（一条重链和一条轻链的片段）和HH（两条重链的碎片）之间。众所周知，CE-SDS缺乏用作制备工具的能力，无法在电泳图中收集足够的抗体片段以进行进一步表征。SEC-HPLC是用于抗体大小变体定性和定量分析的最常用的色谱分离技术。通常在自然条件下使用，水溶液作为流动相，可以收集并浓缩压裂液以进行进一步表征。因此，为了更好地理解和确定观察到的片段-1的身份，采用SEC-HPLC分析来分析和收集观察到的mAb-X片段。图1B显示了对照样品和mAb-X强制降解样品的SEC-HPLC分析色谱图。在强制降解样品中的单体峰后发现了一个明显的肩峰，但在对照样品中没有，这表明在强制降解样本中产生了额外的mAb-X片段。使用CE-SDS和SEC-HPLC对收集和浓缩的mAb-X单体肩后峰进行了重新分析。如图1所示，收集到的肩峰后的洗脱时间与强制降解样品中片段-1的洗脱时间高度一致，这表明SEC-HPLC中单体的肩峰与CE-SDS分析中的片段-1相对应。
mAb-X和片段-1的完整和简化的LC-MS分析
RP-LC-MS是一种强大的技术，通常用于鉴定mAb或其他生物制剂的降解物种和主要的翻译后修饰。因此，为了进一步确认片段-1的身份和组成，使用LC-MS通过SEC-HPLC分析mAb-X和收集的片段-1的完整和降低的分子量。表1总结了完整和还原的mAb-X和碎片-1的理论和测量质量。图2A显示，mAb-X对照样品显示了一个完整的典型IgG Fc聚糖分子，其G0F/G0F（146225 Da）、G0F/G1F（146387 Da）和G0F/G2F或G1F/G1F的分子量与其理论质量高度一致。如图2B所示，片段-1的完整质量包含95192 Da、95751 Da和96309 Da的三个主峰，分别归因于2LC2HC（1–226）、2LCHC（1–26）HC（1−232）和2LC2HC（1–232）的mAb-X F（ab′；LC：轻链；HC：重链）。完整质量分析表明，片段-1可能是由于Glu226Phe227和Ser232-Val233在下铰链区的肽键水解而产生的，类似于IgG胃蛋白酶蛋白水解形成的F（ab′）2片段。
抗体还原成分的较小尺寸使得LC-MS在更高分辨率下的分析更容易、更准确。图3C显示了还原mAb-X对照和强制降解样品的紫外LC光谱。如图2D和E所示，所获得的mAb-X对照样品的紫外色谱图仅显示了两个峰，根据其解卷积质量，这些峰归因于mAb-X的LC和HC。然而，还原片段-1紫外色谱包含LC和其他三个峰，但不包含HC。这三个峰的质量分别为23356Da、24233Da和24791Da，对应于LC（N-末端pyroE-LC）、HC（1-226）和HC（1-232）的N-末端谷氨酸环化，如图2F所示。由于mAb-X的储存温度升高到40°C，N-末端pyroE-LC可能从LC降解。HC（1-226）和HC（1-232）片段是mAb X F（ab′）2的还原重链片段，通过完整质量分析鉴定为2LC2HC（1-226。这些结果进一步表明，片段-1由Glu226-Phe227和Ser232-Val233的下铰链区肽键断裂产生的mAb-X F（ab′）2片段组成。
通过胰蛋白酶消化肽图谱和LC-MS/MS分析确认片段-1的身份
众所周知，CE-SDS和RP-LC-MS在抗体大小分析中具有不同程度的测量误差和偏差，为了解决这个问题，进行了胰蛋白酶消化肽图谱和LC-MS/MS分析，以最终确定产生片段-1的确切肽键切割位点。mAb-X对照和强制降解样品均经胰蛋白酶消化后注入LC-MS/MS分析。众所周知，肽中精氨酸（R）和赖氨酸（K）的C末端可以被胰蛋白酶水解，而mAb-X铰链区的正常胰蛋白酶消化肽是肽HC（215–241）（即N末端重链肽，氨基酸位于215至241位）。
HC（215–241）在下铰链区含有Glu226-Phe227和Ser232-Val233的肽键，表明它们被完整和还原的LC-MS分析水解，导致片段-1的形成。当Glu226-Phe227和Ser232-Val233的肽键在强制降解样品中被切割时，胰蛋白酶消化的mAb-X样品中可以产生另外两种肽HC（215–226）和HC（215-232）。因此，肽HC（215-241）、HC（215-226）和HC（215-232。三种肽的质荷比（m/z）如图3C-E所示，这三种肽检测到的m/z与IAM烷基化肽的理论质量高度一致。由于质谱检测器中不同肽的MS响应不同，HC（215-226）和HC（215–241）的百分比难以定量和计算，并且发现与完整和简化的LC-MS分析结果中显示的百分比不同。进一步对这三种肽进行串联质谱分析，以确认肽HC（215-226）、HC（215–232）和HC（215—241）的序列。在串联质谱分析过程中，三种肽通过碰撞诱导解离而断裂，这破坏了背键酰胺键，产生了一系列C端y离子和N端b片段离子。如图4A-C所示，所有观察到的CID片段离子与肽HC（215–226）、HC（215-232）和HC（215——241）的理论y、b离子完全匹配。这些结果，再加上完整和减少的质量分析，最终证明片段-1是由mAb-X下铰链区的肽键Glu226-Phe227和Ser232-Val233的切割特异性产生的。
mAb-X的pH依赖性片段化和pepstatin A对片段-1形成的抑制
由于其柔性和溶剂暴露的特点，铰链区是单克隆抗体最常见的裂解位点，裂解会受到物理、化学或生物因素的极大影响，如储存温度、制剂pH值、特殊的金属离子催化和反应性残留宿主细胞蛋白酶。对于mAb-X，通过CE-SDS分析，在pH值范围为4.0-6.0的强制降解样品中，在40°C下储存28天，发现碎片-1形成的破碎率存在显著差异。图5A显示了pH 4.0、5.0和6.0下mAb-X强制降解样品的CE-SDS电泳图。CE-SDS电泳图清楚地表明，当mAb-X样品的pH值在40°C下从6.0降至4.0并持续28天后，片段-1的含量急剧增加。图5B显示了不同pH值和孵育时间下mAb-X强制降解样品中片段-1的定量分析。获得的片段-1的百分比范围为2.8%至31.2%，pH值从6.0降至4.0，在40°C下孵育28天。与pH 5.0和6.0相比，pH 4.0的破碎速率要快得多。此外，非还原SDS-PAGE进一步用作可视化正交分析方法，以验证mAb-X的高度pH依赖性裂解。如图5C所示，未受应力的mAb-X对照样品仅显示分子量约为150 KD的主要mAb X单体带。然而，在40°C下孵育14天和28天时，在没有pepstatin a的情况下，mAb-X样品的单体条带逐渐消失，形成95KD的低分子量片段。还可以观察到，破碎率也从pH 4.0急剧降低到6.0，这与CE-SDS分析中观察到的结果高度一致。相比之下，在pepstatin A存在的情况下，mAb-X强制降级样品的95KD片段带没有发生进展性变化，这表明裂解是一种蛋白水解过程，pepstatine A显著抑制了这一过程。上述CE-SDS和SDS-PAGE分析结果正交表明，片段-1的产生高度依赖于pH值。
一些文献报道，微量CHO宿主细胞酸性蛋白酶会显著影响单克隆抗体或其他治疗性蛋白质的稳定性，其裂解率通常高度依赖于pH值。胃蛋白酶抑制剂A是一种酸性蛋白酶（天冬氨酸肽酶）的高选择性抑制剂，与胃蛋白酶和组织蛋白酶D等酸性蛋白酶形成1:1的复合物。因此，进行了一项酸性蛋白酶抑制研究，以区分mAb-X的裂解是否是由微量CHO宿主细胞酸性蛋白酶引起的。向mAb-X样品中加入10μg/ml的pepstatin A，在40°C下孵育28天，然后通过CE-SDS和SDS-PAGE进行分析。如图5所示，在pH值为6.0至4.0的条件下，添加pepstatin A的mAb-X强制降解样品的电泳图中没有观察到片段-1。这些结果表明，片段-1在高温下被pepstatin A有效抑制，并表明片段-1可能是由残留的CHO宿主细胞酸性蛋白酶从mAb-X中产生的。HCP的有效去除是mAb纯化过程中的一个主要因素，通过CE-SDS或其他分析方法进行mAb纯度分析，可能难以直接区分痕量活性蛋白酶的存在。报告的病例通常表明，痕量宿主细胞蛋白酶通常会显著影响生物制剂在高温或长期储存下的稳定性，应在单克隆抗体纯化过程的初始步骤中去除，以降低产品开发风险。
A蛋白亲和纯化优化消除mAb-X片段化
蛋白A色谱与一个或两个其他抛光色谱步骤相结合的策略通常用于将宿主细胞蛋白质降低到监管机构要求的可接受水平。据报道，使用高pH值和高盐缓冲液的洗涤后步骤会破坏HCP与mAb或色谱树脂之间的共洗脱，从而增加mAb产品中HCP的清除率在这项研究中，采用了一种改进的蛋白A色谱法，其中0.05 M tris含有0.5 M精氨酸（pH 8.5）作为洗涤后缓冲液，以提高mAb-X纯化过程中HCP的去除能力。原始工艺I和优化工艺II的最终mAb-X原料药在相同的缓冲液和赋形剂（pH 6.0）中配制，并在40°C下储存28天。CE-SDS分析结果如图6所示，发现纯化过程I的两批mAb-X产物检测到片段-1的存在，纯化过程II的两批单克隆抗体X产物中的片段被成功消除。此外，还将pepstatin A添加到mAb-X中，用于模拟过程I和过程II的样品。在添加了pepstatin A的所有mAb-X样品的电泳图中没有观察到片段-1（图6）。这些结果进一步证实，观察到的mAb-X片段化肯定是由残留的CHO宿主细胞蛋白酶引起的。通过使用针对来自模拟转染的CHO细胞的浓缩条件培养基产生的多克隆抗体开发的内部ELISA测定法，监测澄清的CHO细胞上清液、蛋白A产物和过程I和过程II的药物物质的总HCP水平。发现最初澄清的CHO细胞上清液含有191396 ng/mg的总HCP（表2）。过程I和过程II的蛋白质A步骤都非常有效，HCP的总水平分别降低了100倍和400倍以上。如表2所示，来自工艺I和工艺II的两个独立批次的中间蛋白A产品的HCP定量检测结果分别为2537 ng/mg、1902 ng/mg和534 ng/mg，461 ng/mg。尽管工艺II的原料药中HCP含量仅略低于工艺I的原料药（表2），但片段-1仅在工艺I的mAb-X产物中产生。这一现象表明蛋白酶活性并不总是与HCP水平一致，但可能与残留HCP的特定种类有关。Cordoba及其同事报告说，即使有高水平的CHO HCP，根据HCP加标研究，归因于蛋白水解活性的mAb片段化也不一定发生。蛋白酶诱导的裂解破坏了单克隆抗体分子的完整性，导致产物的生物活性和功能中断。在工艺开发的早期鉴定残留蛋白酶活性可以为改进纯化工艺和减少或消除碎片提供机会。高温下的加速或强制降解研究可用于研究样品或药物早期残留的宿主细胞蛋白酶。这种工艺开发策略可能有利于通过早期实施纯化工艺优化来提高产品质量，从而使单克隆抗体的配方开发更加顺利和成功。
