【Nat Communi】敲除一个基因，增强马铃薯对多种胁迫的抗性！

近日，来自瑞典农业大学植物保护生物学系Erik Andreasson团队，在《Nature Communications》杂志发表了题为“Enhanced stress resilience in potato by deletion of Parakletos”的文章。该研究通过马铃薯蛋白质组学，鉴定出Parakletos，一种与疾病敏感性有关的类囊体蛋白。证实Parakletos基因敲除或沉默可以增强对卵菌、真菌、细菌、盐分和干旱的抗性，而其过表达则减少了抗性。在对生物刺激的响应中，Parakletos过表达的植物，活性氧和钙离子信号明显降低，而Parakletos沉默后则相反。并且在主要作物中都已鉴定出Parakletos的同源物，利用连续多年的田间试验，表明Parakletos的缺失增强了对晚疫病（Phytophthora infestans）的抗性并增加了马铃薯的产量。这一发现标志着该基因可以被用来增强作物对非生物和生物胁迫的抵抗力，在低投入农业生产中具有一定的应用潜力。

为了评估发现的蛋白的功能，作者选择了五个候选蛋白：每个候选蛋白在用农杆菌处理后，在普通烟草(N. benthamiana)中鉴定了这些候选蛋白的同源物。这些候选蛋白在随后被感染了致病疫霉(Phytophthora infestans)的N. benthamiana植物中被短暂表达或沉默。被选为功能性验证的候选蛋白之一是一种小蛋白M1CUF4，被命名为Parakletos。Parakletos的过表达增加了P. infestans在病斑直径、孢子囊计数和P. infestans生物量方面的感染程度，而其沉默则表现出相反的表型（图1a、b）。Parakletos与任何已知的域或蛋白质没有显著的同源性，定位结果表明Parakletos包含类囊体转运肽和类囊体腔转运肽（图1c）。作者构建了一个与mCherry的C末端融合的Parakletos，并在N. benthamiana中短暂表达，预测的亚细胞定位。结果分析显示在类囊体分离后其定位在类囊体（图1d），并且共聚焦成像显示Parakletos仅定位在叶绿体中（图1e）。此外，在N. benthamiana和马铃薯中flg22（细菌鞭毛蛋白上的一个22个氨基酸的序列）处理后Parakletos蛋白水平迅速和短暂降低（图1e、f）。利用蛋白质组学数据的Parakletos的三个质谱肽段和在四个马铃薯等位基因和N. benthamiana中Parakletos成熟蛋白的保守性与Parakletos同源的序列比对表明，在被检测的主要作物中都含有这个基因（图1g）。

Parakletos负向调节活性氧(ROS) 爆发、钙离子流动和防御相关基因的转录。在N. benthamiana植物中Parakletos被过表达或沉默后，flg22处理引起的两种主要次级信使ROS和Ca2+浓度的变化。Parakletos过表达显著减弱了flg22诱导的第一次ROS爆发的幅度，而其沉默则增强了ROS的爆发（图2a, b）。Flg22诱导与ROS检测表明，ParakletosmCherry的表达使得植物中产生的ROS爆发信号比mCherryEmpty载体（EV）植株中的信号更弱。大约120分钟后开始的第二次ROS爆发，在Parakletos沉默的植物中比在对照组中更强（图2c）。此外，编码ROS生成酶的RBOHB基因的表达在TRV2:Parakletos植物中增加（图2d）。而flg22诱导的Ca2+爆发在Parakletos过表达的植物中不那么强烈，在Parakletos沉默的植物中更强烈（图2e, f）。这些发现表明Parakletos是ROS和Ca2+免疫相关信号的抑制因子。在flg22暴露和P. infestans感染后，对产生的植物进行了ROS和Ca2+测定,结果发现，Parakletos沉默增强了flg22诱导的第一次和第二次ROS爆发。在同时沉默了Parakletos和CAS的植物中，ROS爆发并不比TRV2:GFP对照或TRV2:CAS植物中的更强（图2m），但明显弱于仅沉默Parakletos的植物。Ca2+测定也发现了类似的结果（图2n）。此外，与TRV2:GFP对照相比，P. infestans感染严重程度在TRV2:Parakletos植物中降低，而在TRV2:Parakletos/CAS和TRV2:CAS植物中的感染严重程度与对照组没有显著差异（图2o）。

由于Parakletos通过ROS和Ca2+改变了保守的压力信号传导途径，作者进一步研究了各种胁迫条件对Parakletos基因敲除后马铃薯突变体的影响。这些突变体比野生型(WT)对照组受到P. infestans（半生物型）和Alternaria solani（坏死型）的感染程度要轻（图3a, b）。我们还使用细菌病原体Dickeya dantatii（坏死型）和Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 HopQ1（半生物型）在Parakletos沉默的N. benthamiana植物中进行了病害测定。同样，Parakletos沉默植物的感染程度低于对照组（图3c, d）。通过盐分和干旱压力实验表明，Parakletos基因敲除土豆突变体比对照组更耐受这些压力条件（图3e, f）。结果表明，在植物高度、生物量或其他可见性状方面，Parakletos突变体与Desiree-WT对照组之间没有显著差异。这些结果表明，Parakletos功能丧失增加了植物对生物和非生物压力的韧性，且在控制条件下不影响植物生长。

马铃薯晚疫病由P. infestans引起，是一种主要病害，不仅严重降低土豆产量，而且需要大量使用杀菌剂来根除。因此，在控制条件下测试了Parakletos突变体之后，在瑞典南部进行的开放GM级田间试验中评估了它们的生长和对P. infestans的抗性（图4a）。Parakletos突变体系（parakletos-19和-24）和Desiree-WT对照组在随机区组设计中进行了四次重复培养。作者发现，Parakletos突变体系的晚疫病严重程度显著低于Desiree-WT对照组（图4b, c）。在两年的测试中，与Desiree-WT相比，KO系在没有针对P. infestans的杀菌剂处理的地块中产量至少增加了20%。此外，我们观察到Parakletos突变体系和Desiree-WT对照组在生长参数或可见性状上没有显著差异（图4d）。在同一地点的平行试验中，但使用了标准有效的杀菌剂处理（无可见病害），作者没有发现Desiree-WT和KO系之间的产量有显著差异（图4e）。这些结果表明，敲除Parakletos不仅可以增加对P. infestans的抗性，而且能够在没有明显影响生长的情况下增加产量。因此，Parakletos可以成为未来可持续农业的工具。