自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，大隅良典也靠着自噬获得了诺奖。
所以，今天要给你讲的这篇文章，其实跟自噬没什么特别大的关系，讲的是个自噬调控分子。这篇文章发表在Cellular Signalling上（IF=4.191），上了4分的文献告诉你蛋白互作要怎么做。
首先要给你灌输的一个柯霍氏法则，啥是柯霍氏法则?其实简单点说，去掉了某个因素之后，原有的功能丧失，就可以证明这个因素是实现这个功能的关键。
啥？没懂？
好的，给你讲个故事，你就明白了。从前有个专家，做了个实验，他拿了一只蜘蛛放桌子上，他叫了一声“跳！”，然后蜘蛛跳了一下。接着他把蜘蛛的腿都卸掉了，又叫了一声“跳！”，然后蜘蛛动也没动。于是他记录道：蜘蛛的耳朵长在腿上。没毛病……
好了，看完这个，你对柯霍氏法则是不是有了个概念？
那我们接着看这篇文章哈（警告，以下部分速读太快，请系好安全带，并点击下面的“发车”，然后观看，会让你有超速、压线、逆行的快感）：
摘要部分，我就截取了这么一段，告诉你他们大概做了撒花，一共是三大块：1）共定位；2）蛋白互作；3）凋亡表型。
那他们用了什么样的实验来证明呢？我帮你们总结了一下，大致来说，做了上面这些实验，主要也是为了摘要中的三大块服务的。
接着我们可以看到共定位部分，两个蛋白要相互作用，肯定要共定位一下。起码这俩蛋白需要在一起出现，才能相识相恋相爱是吧，总不能在文章里说这俩蛋白通过粒子纠缠式的网恋，完全是柏拉图式的爱情。但边上为啥要做突变？呃，很简单，还记得刚才的蜘蛛腿么？A蛋白只能抓住B蛋白的腿，但是把B蛋白的腿卸了，A蛋白就注定孤独一生了。
接着他们做的是Co-IP实验，有的人可能不知道啥是Co-IP，那首先我们要简单讲一下IP，这个比较简单，就是先在A蛋白上加上一个标签，然后用抗体去拽这个标签，把A蛋白吸在一个大球上，因为A蛋白能和B蛋白结合啊，那B蛋白势必也会被拉下来，这就是IP。那Co-IP呢？其实就是反过来在用B蛋白拉一遍A蛋白，这两个IP合在一起，就被称为Co-IP。
接着是Pulldown，其实原理跟IP差不多，IP是互相拉过表达的蛋白，Pulldown就是拉内源性的细胞自身表达出来的蛋白了。接着还是刚才的蜘蛛腿实验，证明一下突变后，互作变弱了。
说了半天，终于要到表型了，一个是凋亡表型，一个是自噬表型，这里全部先由明星分子代替了。可以看见作为自噬促进剂的TMEM47可以有效抑制凋亡。
最后用流式再验证了一下凋亡表型，这个时候可以证明的是TMEM47可以抑制凋亡，但这和BIK有啥关系呢？于是把刚才论证过的TMEM47或BIK突变后两者互作变弱，就做了一下这样的验证，分别突变这俩蛋白后，凋亡表型的变化是什么。然后发现，确实变弱了，于是证明TMEM47通过和BIK的互作，抑制细胞凋亡。
李莫愁博士：对于实验还是不太理解的，可以拉到下面看延伸阅读哈。我们来看看整篇文献的结构哈：
不要问之前Methods里说的酵母双杂是啥，其实就筛库，找出相互作用的蛋白。他们是用自噬激活蛋白TMEM47去筛库的，筛出BIK后才会有接下来的实验。但双杂实验只是一个提示，接着需要用共定位和Co-IP来进行验证。同样，对蛋白突变后，进行检测，就可以发现具体两个蛋白结合的位置了。
在验证两个蛋白的互作后，需要再进一步证明的就是这个结合对这两个蛋白相互表型之间的关联性了。于是他们做了相关的流式凋亡实验，以及凋亡和自噬相关蛋白的实验来验证。但这只能证明TMEM47蛋白还能抑制凋亡，没BIK蛋白什么事，于是就拿出了这俩蛋白互作来进行了验证。
虽然看起来还是蛮完整的，但是并不是特别严谨，为啥？那你再好好琢磨琢磨蜘蛛的听力问题吧。好了，今天就先策到这里吧。
延伸阅读：
特殊任务——Co-IP
近20分的眼花缭乱Co-IP文献的打开方式
Y2H Screen，GPS导航仪！
柯霍氏法则的科研思路到底是咋回事？
真的假的？结核杆菌来教你怎么做基因的研究？！
