Immunity：冯平辉组揭示 CTPS1 参与调控抗病毒免疫的分子机制

丁香学术 · 公众号 · · 2024-12-29 16:58

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胞苷三磷酸合成酶1（Cytidine triphosphate synthases 1, CTPS1）是调控嘌呤生物合成的关键蛋白。它是催化 UTP 转化成 CTP 的限速酶 ¹ 。CTP 是病毒复制的必须原材料，在合成病毒核酸和蛋白过程中发挥关键作用。然而，CTPS1 在病毒感染过程中的功能及其参与调控病毒与宿主间相互作用的分子机制却从未被研究过。

2024 年 12 月 23 日，美国南加州大学冯平辉研究团队（第一作者为饶友亮博士和秦超博士）在 Immunity 上发表题为 「Pyrimidine synthesis enzyme CTP synthetase 1 suppresses antiviral interferon induction by deamidating IRF3」 的研究论文。该研究发现 CTPS1 在抗病毒天然免疫中通过催化干扰素调节因子 3（Interferon regulatory factor 3, IRF3）脱氨基，使 IRF3 失去结合 dsDNA 的能力，从而抑制其对干扰素以及下游 ISGs 的转录激活。当免疫激活时，糖原合成酶激酶 3β (Glycogen synthase kinase 3 beta, GSK3β) 通过磷酸化 CTPS1 来抑制 CTPS1 介导的 IRF3 脱氨基以促进干扰素反应。这一研究成果揭示了 CTPS1 直接参与调控抗病毒免疫的分子机制，拓宽了人们对代谢酶参与调控免疫反应的认识。

冯平辉教授团队常年致力于研究病毒与宿主的相互作用。近年来，在病毒利用蛋白质脱氨逃逸宿主免疫方面取得了一系列原创性研究成果，发现细胞或病毒含有谷氨酰胺氨基转移酶（Glutamine amidotransferase, GAT）结构域的蛋白可以作为蛋白脱氨酶，催化如 RIG-I、cGAS 等分子脱氨基，从而抑制抗病毒免疫的激活 ^2-4 。

人类基因组共编码 11 个含有 GAT 结构域的蛋白。在本研究中，作者利用慢病毒介导的基因敲降系统，筛选这 11 个 GAT 蛋白对 IFN-I 诱导的影响，结果发现在 SeV 感染后，敲降 CTPS1 显著增强了 IFN-I 的诱导水平，而对 NF-κB 的诱导没有影响。这一结果在 CTPS1 敲除的 293T 细胞和 THP-1 细胞中得到验证。在哺乳动物中 CTPS 家族包含两个成员：CTPS1 和 CTPS2。通过检测 CTPS1 和 CTPS2 敲降细胞内 CTP 水平以及 CTPS 酶活实验，发现 CTPS1 在 CTP 合成中发挥主导作用。然而，在 CTPS1 敲除细胞中回补 CTP 并不能影响抗病毒免疫基因的表达，这说明 CTPS1 介导的免疫抑制不是由 CTP 的改变所导致的。在 CTPS1 条件性敲除小鼠模型中，CTPS1 敲除增强了 VSV 引起抗病毒免疫基因表达，同时抑制了病毒复制和和感染引起的肺组织损伤。

为了寻找 CTPS1 在抗病毒信号通路中的靶点，作者研究了 CTPS1 敲降对 RIG-I-IFN-I 信号通路中的关键分子（RIG-I-N、 TBK1 和 IRF3-5D）介导的 IFN-I 诱导的影响。结果发现 CTPS1 敲降增强了 RIG-I-N、TBK1 和 IRF3-5D 介导的干扰素诱导水平。而 IRF3 是 RIG-I-IFN 信号通路最下游的调节分子，因此，CTPS1 极有可能靶向 IRF3。Co-IP 实验结果表明，IRF3 与 CTPS1 相互作用，而不与 CTPS2 相互作用。二维电泳结果显示，敲降 CTPS1 或者表达 CTPS1 转氨酶失活突变体（CTPS1-GD）使 IRF3 向胶条的负极迁移，意味着 IRF3 正电性的增强。这与 CTPS1 可能催化 IRF3 脱氨基的假设一致。为了鉴定 CTPS1 的催化位点，研究者从 IRF3 单独表达和 IRF3/CTPS1-GD 共表达的 293T 细胞中纯化 IRF3 做串联质谱分析。结果发现一些位点的脱氨基修饰水平受 CTPS1-GD 的影响。随后，构建这些位点的脱氨基突变（N>D、 Q>E），并研究其对 IFN-I 诱导的影响，结果发现，IRF3-N85D 几乎完全阻断了 IRF3 对 IFN-I 的诱导，这与 CTPS1 抑制干扰素反应是一致的。体外脱氨实验结果表明，CTPS1-WT 增强了 IRF3 的负电性，而 CTPS1-GD 突变体不影响 IRF3 的电荷水平。同时，敲降 CTPS1 抑制 IRF3-WT 的负电性，而对 IRF3-N85D 的电荷水平无影响。这些结果说明 CTPS1 催化 IRF3-N85 位点脱氨基。

随后，作者构建 IRF3-N85D 和 IRF3-N85A（脱氨抗性突变）重组的 Irf3 ^-/- Irf7 ^-/- MEF 稳定细胞系，以及 IRF3-N85D 和 IRF3-N85A 基因敲入的 293T 细胞系。当 SeV 感染以后，IRF3-N85D 几乎完全丧失了诱导 IFN-I 及其下游 ISGs 表达的能力，而 IRF3-N85A 引起了比 IRF3-WT 更强的免疫激活。进一步的机制研究发现，IRF3-N85D 不影响 SeV 感染引起的 IRF3 磷酸化、二聚化和质核迁移，但是抑制了 IRF3 结合 DNA 的能力。因此，CTPS1 介导的 IRF3 脱氨基是通过阻断 IRF3 与下游免疫基因的启动子结合来抑制抗病毒免疫反应的。

为了研究 IRF3 脱氨基突变体的体内功能，研究者构建了 Irf3 ^N85D/N85D 和 Irf3 ^N85A/N85A 基因敲入小鼠。在 RNA 病毒（VSV）和 DNA 病毒（HSV-1）感染以后，抗病毒免疫反应在 Irf3 ^N85D/N85D 小鼠中被抑制，最终导致病毒复制增强，被感染组织病变加重以及小鼠的死亡率增加。相反，与野生型小鼠相比，Irf3 ^N85A/N85A 引起了更强的免疫反应，从而抑制病毒复制并降低小鼠死亡率。

基于 CTPS1 在抗病毒免疫中的负调控功能，研究者推测 CTPS1 在宿主免疫激活时可能被抑制。为此，作者用高剂量的 VSV 和 HSV-1 感染 THP-1 细胞以激活抗病毒天然免疫。结果发现，病毒感染抑制了 CTPS1 的酶活性以及 IRF3 的脱氨基修饰。最后，作者通过串联质谱分析和生化实验发现，在免疫激活状态下，GSK3β 通过催化 CTPS1-S575 位点发生磷酸化来抑制 CTPS1 的活性，从而保证抗病毒免疫的正常启动。

总之，该研究发现了 CTPS1 的一个 moonlighting function，揭示了代谢酶直接作用于天然免疫关键信号分子去调控免疫激活的分子机制，建立了嘧啶合成代谢与天然免疫应答之间的分子联系，拓宽了人们对代谢酶功能的认识，为开发针对 CTPS1 的抗病毒药物提供了新方向。

参考文献：

1. Lynch, E.M. et al. Human CTP synthase filament structure reveals the active enzyme conformation. Nat Struct Mol Biol 24, 507-514 (2017).

2. He, S. et al. Viral pseudo-enzymes activate RIG-I via deamidation to evade cytokine production. Mol Cell 58, 134-146 (2015).

3. Zhang, J. et al. Species-Specific Deamidation of cGAS by Herpes Simplex Virus UL37 Protein Facilitates Viral Replication. Cell Host Microbe 24, 234-248 e235 (2018).

4. Zhao, J. et al. A Viral Deamidase Targets the Helicase Domain of RIG-I to Block RNA-Induced Activation. Cell Host Microbe 20, 770-784 (2016).

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1074761324005351

审核：饶友亮

图片版权：Immunity、图虫创意

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