分享 | 如何构建单克隆细胞群？

由单个细胞繁衍所形成的的细胞群就叫单克隆细胞群。如今慢病毒转染构建稳定表达细胞系，以及crispr/cas9的普及，很多实验工作人员都在寻找构建单克隆细胞群的方法。

特别是做肿瘤相关研究的，单克隆细胞群的构建显得尤为重要。做这个实验要做好时间大概一个月甚至需要更久。不过，如果构建成功单克隆细胞群成功的话，相信文章的档次也将升一个台阶。

首先收集适应性的培养基，这一步是实验的关键。很多人做这个实验的时候细胞总活不了的原因就在这。因为新鲜的完全的培养基里不含细胞生长所需的细胞因子，所以如果直接做单克隆实验经常会发现细胞还没分裂就死了。

步骤：

1.培养同源细胞 (未克隆前的同一细胞株) 至半汇合状态，更换一次培养液，再培养24h，吸出所有培养液，以3000r/min离心，再经滤器过滤（目的去除细胞及其残渣），注意防止污染。其次配制细胞培养所需要的应用液。

2.取一份适应性培养基加 2 份培养液

最后就是通过无限稀释的方法，分离出细胞。

3.取一瓶处于对数生长期的细胞或者转染的细胞系，按常规消化、离心、计数，

4.稀释：将细胞稀释成每100ul约含50个细胞，打匀，

5.点种：用 20uL移液枪吸取细胞悬液先点几个孔，每孔约 2uL，其液滴如芝麻大小，然后在倒置显微镜下观察，如每孔 1～2 个细胞，说明细胞浓度合适，则可一次点完 96 孔板。若不然，则可使液滴增大或缩小，或者再加细胞，或者再加培养液稀释。

6.记录：在倒置显微镜下观察 96 孔板，将只有单个细胞的序号记录下来，然后仅给单个细胞孔加培养液200uL（应用液），置 CO2 培养箱或者空气培养箱培养。（事实上文献是这么做的，但是在倒置显微镜中，细胞没贴壁的情况下观察细胞个数非常困难，即使看到了一个细胞的，也有可能不是单个细胞。所以建议4-8h细胞贴壁后再行显微镜下观察，肿瘤细胞是单个细胞的做一下标记）

7.连续观察几天，会发现有一些孔的单个细胞并没有成活，这一部分孔就可以剔除掉。几天之后细胞分裂完注意只要有一个单克隆的细胞群的孔留下，其余的都不要。

刚开始细胞长得比较慢，不用着急，也不用换液，等细胞长得比较好，一个细胞克隆群长到接近20个细胞的时候，这时候就可以将细胞消化下来，换到24孔板里样。（一般情况下，96个孔，细胞数量控制得好，一个96孔板能够构建10个左右的单克隆细胞群）。

8.接下来就正常培养，24孔板移到12孔板，再移到6孔板，从24孔板移到12孔板就不需要应用液了，用新鲜的培养基就行了。

整个实验过程，如果是2天就能传一次代的细胞，一般一个月左右就能构建成功单克隆细胞群。