抗体偶联药物分析方法

利用抗体实现细胞毒性药物靶向递送的理念可追溯至上世纪初。随着基因工程技术、抗体制备技术的成熟，以及新型化学连接技术的出现，近年来这一领域取得了里程碑式的发展，并实现了药物的临床转化。抗体偶联药物（ antibodydrug conjugate ， ADC ）是一类通过化学偶联子将单克隆抗体和不同数目的小分子细胞毒素（效应分子）偶联起来的药物。这种新型的药物结合了单克隆抗体的高特异性和小分子毒素的高活性。 ADC 药物的分析工作非常困难和费时，主要归因于分析物的多样性及分析方法的复杂性 与传统的抗体药物或者细胞毒性药物相比，抗体偶联药物具有更为复杂的结构和质量属性。抗体偶联药物由两个部分即抗体和药物通过接头分子连接而成。开发安全性高、疗效好的 ADC 药物有赖于抗体、药物的选择，以及接头技术的优化三个方面的共同发展。同时，其复杂的质量属性对抗体偶联药物的质量控制也提出了更高的要求。

针对不同类型的分析物，研究者们需要根据药物开发和评价的不同目的以及待测物的特点，选择不同的分析手段，以不同的标准来完成检测任务。在理化特性方面的重要研究对象是药物 - 抗体比（ drug-to-antibody ratio ， DAR ），研究者一般采用光谱法、色谱法及质谱法对其进行半定量分析。在药代动力学研究方面，研究者需要对多种具有意义的分析物浓度进行精确定量，一般应用配体结合法（ ligand binding assay ， LBA ）如酶联免疫吸附法（ enzyme-linked immunosorbent assay ， ELISA ）（对抗体偶联物和总抗体）和液相色谱 - 串联质谱联用法（ liquid chromatography-tandem mass spectrometry ， LC-MS/MS ）（对结合型和游离的小分子毒素以及毒素相关代谢物）。在免疫原性测定方面，研究者一般采用 LBA 法如 ELISA 和桥联 ELISA 等对 ATA 进行定性或半定量分析。

一、抗体偶联药物的关键质量属性分析方法

与单纯的单克隆抗体相比，抗体偶联药物在结构上更加复杂，除了抗体药物具有的质量属性外，还会引入与接头、偶联工艺、负载药物相关的其他关键质量属性，这给 ADC 药物的质量控制带来巨大的挑战。随着技术手段的不断进步以及新型抗体的不断涌现，需要将多种分析手段相结合，以及对多种任务所涉及的不同流程进行整合，在这一方面，质谱、毛细管电泳、 iCIEF 、 DSC 、 SP Ｒ技术等先进的技术手段在抗体药物的结构表征、异质性、稳定性、活性等关键质量属性分析方面得到了快速发展。下面就 ADC 药物质量属性分析中用到的传统技术手段、检测方法及其挑战加以介绍，需要指出的是对于 ADC 等新型抗体药物的质量研究，今后应更关注对国际领先的新技术和新方法的开发与探索。

（一）、色谱

针对抗体偶联药物及其酶解产物进行色谱分析能够获得偶联位点数目和位置、游离药物含量和药物抗体偶联比等重要信息。同时，色谱分离技术可以纯化不同组分用于进一步分析。基于疏水（反向高效液相色谱Ｒ P-HPLC 、疏水相互作用色谱 HIC ）、电荷（离子交换色谱 IEC ）和分子大小（分子排阻色谱 SEC ）原理进行分离的色谱技术已广泛用于分析抗体偶联药物。其中，Ｒ P-HPLC 可对不同药物载量的完整 ADC 药物、抗体轻重链以及游离药物进行分离和定量。反向高效液相色谱柱采用烷基链共价结合到非极性固相表面，在高柱温（ 60 ～ 80℃）条件下实现完整抗体蛋白的高分辨率分离。此外，该方法还被用来检测不同ADC 药物中游离药物的水平；采用反向高效液相 - 质谱联用技术检测释放到血浆中和体外培养肿瘤细胞中的游离药物。然而，这一技术的挑战是高柱温和有机流动相无法使 ADC 药物维持天然结构。

疏水相互作用色谱 HIC 是另一种用于分析抗体偶联药物的色谱分离技术，和Ｒ P-HPLC 一样， HIC 也是根据疏水性不同进行分离。不同的固定相（苯基、丁酰基、己基等）具有不同的疏水性和选择特性。通常采用高盐浓度流动相使蛋白结合到固定相，继而降低盐浓度进行洗脱。这种温和的结合与洗脱条件保持了偶联抗体的天然构象，因此该技术也可以用于纯化完整抗体偶联药物。

其他色谱方法如离子交换色谱法被用于评价异质性和抗体偶联药物的药物分布，分子排阻色谱法被用于评价抗体偶联药物的聚集、污染物的去除、降解情况 、 药物分布以及热稳定性等。

（二）、免疫检测法

免疫检测法包括检测抗体偶联药物对靶蛋白的结合； ADC 药物、抗体以及药物的定量分析；评价接头与药物的稳定性；检测与 Fcγ Ｒ的结合以及免疫原性评价。这些检测对于理解抗体偶联药物的效价、药代动力学和安全性具有重要意义。其中，酶联免疫吸附测定法常被用来评价抗体偶联药物的浓度以及与抗原的结合。

用于抗体偶联药物分析的 ELISA 种类包括总抗体 ELISA 、半均质 ELISA 、竞争性 ELISA 和偶联抗体 ELISA 等。特异性总抗体 ELISA 是指在孔板上包被靶抗原或抗独特型抗体，采用酶联种属特异的抗免疫球蛋白二抗来检测 ADC 与包被抗原的结合。采用半均质 ELISA 时，捕获抗体和检测抗体在固定到孔板之前与抗体偶联药物形成复合物，在分析不同药物载量的抗体偶联药物时表现出明显优势。

对于竞争性 ELISA ，首先包被捕获分子（靶抗原或抗药抗体）在孔板上，用于结合固定量标记试剂（即标记的 ADC 或游离药物）。将 ADC 或游离药物的标准物质或样品（竞争物）与固定量的标记试剂预孵育。将整个混合物加入到上述预包被的孔板中，清洗并检测。样品（ ADC 药物或游离药物）浓度越高，检测信号越弱，该方法更适合检测游离药物含量。偶联抗体 ELISA 是通过抗药抗体来捕获 ADC 药物的药物部分，同时联合使用抗独特型抗体或抗人 IgG 抗体，仅检测偶联有药物的抗体，而不检测未偶联的抗体。偶联药物抗体的定量对于体内效价实验，尤其是药物暴露、药代动力学和药效动力学具有重要意义。药物抗体偶联比 DA Ｒ可用来作为评价接头稳定性的通用指标。

免疫检测法所面临的挑战包括：进入循环系统后，抗体偶联药物中的药物释放，导致抗体偶联药物 DA Ｒ发生改变。另外药物与抗体的偶联本身可能影响 ADC 药物与捕获试剂或检测试剂的结合。对于偶联抗体 ELISA ，当采用抗药抗体作为捕获剂时，可能无法均匀地测定不同药物载量的 ADC 药物，而采用抗药抗体作为检测试剂，则可能无法获得与药物分子数目成比例的检测信号。

（三）、质谱

质谱技术可用于评价接头的稳定性，分析游离药物、代谢物、不同 DA Ｒ组分和相对比例等。液质联用技术，如 HIC 或Ｒ P-HPLC 与质谱联用，已用于 ADC 药物结构和组成分析，评价 ADC 药物接头的稳定性，分析 DA Ｒ和偶联位点，测定不同 DA Ｒ组分的相对比例等。

质谱检测技术的挑战之一是无论药物载量的高低，都假定所有物质同未偶联抗体具有相同的离子化效率。因此，应用质谱技术分析 DA Ｒ的前提是假定所有物质具有相同的回收率和电离情况。而实际情况并非总是如此，因为药物与带正电的胺的偶联将导致所带电荷和疏水程度的改变。因此，在进行方法开发的过程中，评价所有的成分是否发生相似的电离很重要。此外，易水解的接头（例如含有腙的接头）可能受酸性的液质条件或激光基质辅助激光解吸 / 电离质谱分析中常采用的酸性基质的影响，导致获得与实际情况不相符的 DA Ｒ。