在癌症研究的漫漫征途中，胰腺癌犹如一座难以攻克的险峻高峰，其高度的异质性和复杂的肿瘤微环境（TME）使得患者预后极差，5 年生存率长期处于极低水平。然而，一项发表于
《Nature Communications》
的前沿研究
Multimodal single cell-resolved spatial proteomics reveal pancreatic tumor heterogeneity（10.1038/s41467-024-54438-0）
，宛如一道曙光穿透迷雾，为我们带来了深入探究胰腺癌奥秘的全新视角与有力工具。
扫码添加 ⬪ 精彩内容抢先看
个性解读｜课题设计
生信热点｜直播分享
一、研究背景：探寻胰腺癌研究困境的破局之法
胰腺癌的恶劣预后很大程度上归因于其肿瘤微环境的高度复杂性与细胞间的显著异质性。传统的研究手段在解析这一复杂体系时面临诸多瓶颈，例如抗体识别技术受限于可用抗体数量，难以全面捕捉细胞内蛋白质组信息；质谱（MS）技术虽强大，但在空间分辨率和细胞类型分辨率方面仍存在不足，难以精确剖析肿瘤微环境中不同细胞类型的蛋白质表达差异及空间分布特征。
激光微切割（LMD）技术结合 MS 的空间蛋白质组学虽取得一定进展，可对组织中的蛋白质进行分析，但存在操作繁琐、细胞类型分辨率低等问题，如依赖人工经验进行病理检查和细胞轮廓标注，易导致结果偏差，且大规模细胞轮廓常包含多种细胞，掩盖了细胞间的细微差异，使得我们对胰腺癌发生发展过程中蛋白质层面的变化机制认识有限，难以找到有效的治疗靶点和生物标志物。
二、研究方法：创新技术平台的构建与应用
本研究匠心独运地打造了空间和细胞类型蛋白质组学（SCPro）平台，整合了多重成像、流式细胞术与离子交换蛋白质聚集捕获（iPAC）技术，为全面解析组织蛋白质组异质性提供了全新方案。
在样本制备环节，iPAC 技术成为关键利器。它基于固相萃取原理，巧妙地串联强阴离子交换（SAX）和 C18 圆盘，有效处理低数量细胞（如少于 100 个细胞甚至单个细胞），尤其是经染色的组织切片样本。其创新之处在于引入 “载体” 表面活性剂 N - 十二烷基 - β - D - 麦芽糖苷（DDM）减少蛋白质非特异性吸附，采用离子交换圆盘提升蛋白质捕获效率，通过原位蛋白质聚集捕获及优化的清洗和洗脱步骤，显著提高了蛋白质鉴定的灵敏度与定量重现性，确保在处理复杂生物样本时能获取高质量的蛋白质组数据。
在细胞成像与分割方面，借助商业化软件的细胞核和细胞膜识别算法，SCPro 平台能够精准地对厘米级多色免疫组化（mIHC）染色组织切片上的单细胞轮廓进行界定，无需耗费大量人力进行手动标注。通过在不同显微镜下巧妙设置参考形状，实现了高质量成像与低质量实时成像间的导航转换，保障了细胞分割的准确性和高效性。随后，利用粘性帽收集技术，在明场可视化条件下，实现了对单细胞的无损失自动捕获，为后续蛋白质组分析奠定了坚实基础。
为提升细胞类型分辨率，研究人员对流式细胞术分选的 14 种胰腺肿瘤微环境主要细胞类型进行蛋白质组分析，获取细胞类型特异性蛋白质组数据，并以此为参照，运用空间去卷积算法对空间蛋白质组数据进行深度解析，从而更精确地推断不同组织位置的细胞组成和比例，挖掘潜在的细胞亚型信息。
三、研究结果：胰腺癌微环境的深度洞察
（一）iPAC 技术性能卓越，为蛋白质组分析保驾护航
图2
研究团队通过一系列严谨实验全面评估了 iPAC 技术的性能。在处理不同量的 HEK 293T 细胞裂解物及分选细胞时，iPAC 展现出强大的蛋白质回收能力，如处理 5 ng、10 ng 和 20 ng 细胞裂解物时，分别鉴定出超过 3000、4000 和 5000 个蛋白质组，且与直接注射预消化样本相比，蛋白质回收效率超 60%，细胞输入量增加时回收效率进一步提高（图 2b、c）。
在分析 H&E 染色的小鼠脑组织切片及胰腺肿瘤组织区域时，iPAC 同样表现出色，能从少量组织样本中鉴定出大量蛋白质组，并具有良好的定量重现性。特别是通过优化的 80% 乙腈（ACN）清洗步骤，显著降低了样本污染，提高了蛋白质鉴定数量和定量准确性，有力证明了其在处理复杂组织样本方面的优势（图 2d - f）。
（二）SCPro 精准剖析胰腺肿瘤微环境，揭示细胞分布与蛋白质组变化规律
图3
运用 SCPro 平台对胰腺肿瘤微环境进行研究，研究人员获取了高分辨率的多色成像数据，清晰呈现了胰腺导管腺癌（PDAC）发生发展过程中不同细胞类型的空间分布变化。定量组织细胞术分析表明，从正常腺泡细胞到胰腺上皮内瘤变（PanIN）再到 PDAC，CD45 + 免疫细胞和 αSMA + 癌相关成纤维细胞（CAFs）在肿瘤细胞周围的比例逐渐增加，且不同区域细胞分布存在显著差异，如 PanIN - 1 和 PDAC - 1 区域的免疫细胞和成纤维细胞浸润程度高于 PanIN - 2 和 PDAC - 2 区域，同时距离肿瘤越远，这些细胞比例逐渐降低，揭示了 CAFs 和免疫细胞在肿瘤进展中的重要作用及形成的微环境屏障（图 3b、c，补充图 6、7）。
图4
在蛋白质组层面，对腺泡细胞、PanIN 和 PDAC 细胞的空间蛋白质组分析发现，三者蛋白质表达谱差异显著，腺泡细胞中与消化功能相关的蛋白质如 Cpa1、Reg3g 等表达较高，而 PDAC 细胞中则富集了肿瘤相关通路如伤口愈合和线粒体翻译相关蛋白，这与细胞的生物学功能紧密契合，为深入理解胰腺肿瘤发生机制提供了重要线索（图 4c、d）。
此外，对肿瘤微环境中免疫细胞的研究显示，肿瘤内（IT）和肿瘤周围淋巴结（LN）区域的 CD45 + 免疫细胞蛋白质组存在明显差异，IT 区域富含髓系细胞标志物，LN 区域则以淋巴系细胞标志物为主，且相关功能通路也各具特点，进一步体现了免疫细胞在不同空间位置的功能异质性（图 4f - h）。
（三）空间去卷积
与细胞亚型发现
，拓展对胰腺肿瘤微环境的认知边界
图5
通过整合流式细胞术获取的细胞类型蛋白质组数据进行空间去卷积分析，SCPro 平台成功解析了胰腺肿瘤微环境中不同细胞亚型的组成和比例。研究发现，在 CD45 + 免疫细胞中，髓系细胞是最丰富的亚型，同时 CD8 + T 细胞和树突状细胞比例较低，再次证实了胰腺肿瘤微环境的免疫抑制特性（图 5f）。
图6
图7
进一步对细胞表面膜蛋白的分析挖掘出了多个细胞亚型的潜在标志物。在调节性 T 细胞（Treg）中，发现 Tnfrsf18 和 Klrg1 显著高表达，且通过流式细胞术验证了其在 Treg 细胞中的特异性表达，并基于 Klrg1 表达差异将 CD25 + Treg 细胞分为两个亚型。蛋白质组学分析显示，Klrg1 + Treg 细胞具有更强的免疫抑制和肿瘤促进特征，其相关功能蛋白如 Casp1、Kdelr2、Map4k1 等表达上调，且在激活髓系白细胞方面发挥更重要作用，通过生物验证进一步确认了其免疫抑制功能（图 6）。在人类 PDAC 样本中，也成功鉴定出 KLRG1 + Treg 和 TNFRSF18 + Treg 细胞，且其比例随肿瘤进展增加，与患者不良预后相关，凸显了这些细胞亚型在胰腺癌发生发展中的关键作用（图 7）。
四、研究讨论：SCPro 平台的创新意义与未来展望
SCPro 平台的问世在空间蛋白质组学领域具有里程碑式的意义。与传统技术相比，它有效克服了细胞类型分辨率低、样本处理效率低等难题，通过创新的工作流程和技术组合，实现了对组织微环境中蛋白质组异质性的高精度、高灵敏度解析。iPAC 技术的成功应用确保了在处理有限且复杂的组织样本时能够获取深度蛋白质组信息，为单细胞分辨率的空间蛋白质组学研究提供了有力保障。
空间去卷积算法与细胞类型蛋白质组数据的整合拓展了蛋白质组学数据分析的新路径，不仅能够精确解析细胞组成比例，还成功发现了新的细胞亚型，如 Treg 细胞亚型的鉴定为深入理解胰腺癌免疫抑制机制提供了全新视角，为后续开发基于细胞亚型的精准治疗策略奠定了坚实基础。
展望未来，随着液相色谱 - 质谱（LC - MS）仪器性能的不断提升和数据挖掘算法的持续创新，SCPro 平台有望成为研究肿瘤微环境时空蛋白质组景观和细胞间相互作用的通用利器，助力我们在攻克胰腺癌及其他复杂疾病的道路上迈出更为坚实的步伐。
五、研究总结：开启胰腺癌研究新篇章
本研究创新性地构建的 SCPro 平台为胰腺癌研究带来了前所未有的突破。通过对胰腺肿瘤微环境的多维度、高精度解析，我们在蛋白质组水平上对胰腺癌的发生发展机制、细胞间相互作用及免疫微环境有了更为深刻的认识，尤其是新细胞亚型的发现为寻找潜在治疗靶点提供了新的方向。这一研究成果不仅为胰腺癌研究注入了新的活力，也为整个肿瘤学领域的空间蛋白质组学研究提供了极具价值的范例和思路，有望引领未来相关研究朝着更深入、更精准的方向发展，为改善胰腺癌患者的预后带来新的希望曙光。
