构建骨类器官用于骨缺损的再生治疗策略被证实是高效的。近日，苏州大学李斌教授、陈嵩副教授以及过倩萍副研究员团队利用内源性酶诱导矿化策略以及软骨内骨化模式构建骨类器官，用于实现大鼠股骨缺损的再生。
软骨内骨化即间充质干细胞（
MSC）聚集凝结、软骨分化形成“软骨痂”以及“软骨痂”矿化成骨的过程。人体的大部分骨骼（主要是长骨）都是通过软骨内骨化的发育方式形成的。目前，许多研究将纯干细胞球团或者将干细胞和生物材料支架结合进行软骨诱导，在体外培养构建“软骨痂”类器官。通过将这些的体外培养的“软骨痂”皮下或者原位骨缺损部位植入之后，“软骨痂”可以异位成骨或原位矿化实现骨缺损愈合。然而，少有研究聚焦促进“软骨痂”矿化的进程。受到酶诱导矿化策略的启发，研究者构建了一套内源性酶诱导矿化体系。他们以GelMA水凝胶为载体，在水凝胶内负载软骨球、小分子药物DIPQUO以及甘油磷酸钙（CaGP
）
。利用小分子药物
DIPQUO促进软骨球内源性碱性磷酸酶（ALP）产生，ALP分解CaGP获得磷酸根离子和钙离子，钙离子与磷酸根离子结合可形成矿物对软骨球以及水凝胶矿化，形成骨类器官并实现股骨缺损的修复（Scheme 1）。
研究人员将大鼠骨髓间充质干细胞（
BMSC
）进行软骨诱导，番红和阿尔辛蓝染色证实了
BMSC
良好的软骨分化。随后，研究者发现
10μM DIPQUO
可以显著促进
BMSC
软骨分化后
ALP
生成，并且可以促进
RUNX2
、
p-β-catenin
(
磷酸化位点
Ser675)
等
成骨
相关蛋白的表达
。
接着，
研究者将
BMSC
在体外培养成软骨球，
并
用
DIPQUO
和
CaGP
同时处理软骨球，结果发现
10 μM DIQPUO
和
7.5 mM CaGP
的联合使用
可
显著
促进软骨球的
矿化。然后，研究者将软骨球、
DIPQUO
和
CaGP
负载到
GelMA
水凝胶中，构建内源性酶诱导矿化水凝胶。
7
和
14
天之后，茜素红染色、扫描电镜（
SEM
）以
EDS mapping
等结果分析表明，无论是软骨球还是水凝胶，都发生了显著的矿化（图
2
和
3
）。以上实验成功证实了内源性酶诱导矿化体系可以实现软骨球的矿化。
随后研究者针对软骨球矿化过程中的细胞超微结构以及矿物的产生进行了研究。透射电镜（
TEM
）结果发现，矿化第二天在胞内囊泡的边缘出现电子致密颗粒（钙）的聚集。随着矿化的继续进展，一些胞内超微结构如线粒体、囊泡、溶酶体显著增多。这些表现与软骨球的成骨分化有关（图
4
）。
紧接着，研究者用转录组测序研究软骨球矿化过程的分子机制。测序结果发现，软骨球形成和矿化的过程在基因表达层面上与软骨内骨化一致。
GO
和
KEGG
富集分析表面许多成骨相关的信号通路如
MAPK/ERK
、
Wnt/β-catenin
等
显著富集。随后，研究者用
WB
验证了这两条通路中关键信号分子
p-ERK
以及
p-
β-catenin
的增多，这提示
DIPQUO
和
CaGP
可以激活
MAPK/ERK
和
Wnt/β-catenin
信号通路促成骨。
最后，研究者用大鼠股骨远端缺损模型验证内源性酶诱导矿化体系促进骨修复的能力。
Micro-CT
、组织学染色等结果显示，与对照组以及单纯软骨球组比，内源性酶诱导矿化体系以及由内源性酶诱导矿化体系构建的体外矿化的骨类器官都具有较好的骨修复效果，可以在
4
周内促进股骨缺损的修复。
综上，研究者利用内源性酶诱导矿化策略促进软骨球的矿化，模拟骨发育过程中软骨内骨化的过程，并最终得到矿化良好的类骨结构，为骨再生以及骨类器官的构建提供了思路。
本研究由苏州大学李斌教授、陈嵩副教授
以及过倩萍副研究员
团队完成，并于
2024
年
11
月
22
日在线发表于
Chemical Engineering Journal.
原文信息：
Li Dong
#
,Weiguo Chen
#
,Xi Luo, Chengyuan Liu, Jingxi Xu, Dachuan Liu, Zhao Liu, Huan Wang, Jiaxu Shi, Weicheng Chen, Moyan Li, Jiaojiao Yang, Jiyao Li, Qianping Guo
*
, Bin Li
*
, Song Chen
*
. Constructing bone organoids based on endochondral ossification model via endogenous enzyme-induced mineralization. Chemical Engineering Journal 2024, 502: 157930.
供稿：董立
审校：秦天
编辑：李凯华
