非靶向和靶向代谢组学在药物靶点发现中的应用
范仕成，高悦，张慧贞，黄民，毕惠嫦*
（中山大学药学院，广东 广州 510006）
[ 摘要] 代谢组学是运用多种技术手段，研究生物体系中小分子代谢物的种类、数量及变化规律的科学，是系统生物学的重要组成部分，根据研究目的的不同分为非靶向和靶向代谢组学。非靶向代谢组学是对生物体内源性代谢物进行系统全面的分析；靶向代谢组学则是针对特定的某一类代谢物进行分析。随着信息科学和分析技术的发展，运用代谢组学研究疾病机制和发现药物靶点的方法日趋成熟，其重要性也日益凸显。通过典型实例，介绍非靶向和靶向代谢组学及二者结合在肿瘤、代谢性疾病等药物靶点发现中的作用，为深入理解代谢组学在疾病机制研究和药物靶点发现中的重要作用提供参考和启示。
[ 关键词] 代谢组学；药物靶点；疾病机制
代谢是生物体内所有生物化学反应的总称，代谢活动是生物体维持生命的物质基础，对代谢物的分析是研究生命活动分子基础的一个重要方面。代谢组学最初由英国帝国理工大学Jeremy Nicholson 教授提出，他认为代谢组学是将人体的生理病理过程作为一个动态的系统，研究生物体被内、外环境因素扰动后其内源代谢产物种类、数量及其变化规律的科学。其核心任务包括检测、分析和探索代谢物质的整体变化规律，并通过这种变化规律研究机体生命活动发生、发展的
本质。
基于分析技术和信息技术的迅猛发展，代谢组学发展迅速，与基因组学、转录组学、蛋白质组学等共同组成“系统生物学”，并在系统生物学研究中起着重要作用。与其他组学相比，代谢组学具有明显的优势：1）代谢物水平上发生的变化更易于检测；2）相较于基因组学和蛋白质组学需要进行全基因组测序和建立含有大量表达标签的数据库，代谢组学分析手段更为简易；3）与基因和蛋白数量相比，代谢物数量少，易于确证和进行后续分析；4）生物样本的代谢物和代谢通路变化可以系统地揭示机体生理病理状态。
根据研究目的的不同，可以将代谢组学分为非靶向和靶向代谢组学。非靶向代谢组学是对生物体内源性代谢物进行系统全面的分析，是一种无偏向的代谢组学分析；靶向代谢组学则是针对特定的某一类代谢物进行的分析，是一种有偏向的代谢组学分析。非靶向和靶向代谢组学各有优缺点，二者结合可作为差异代谢物的发现和准确定量的有力工具，在靶点发现的过程中发挥重要作用。非靶向和靶向代谢组学在疾病研究、疾病动物模型的确证、药物研发、药物筛选、药效及毒性评价、药物作用机制和临床评价、植物代谢功能、微生物代谢功能研究等方面有着广泛的应用。在疾病研究领域，代谢组学的应用主要集中在病变标志物的发现、疾病的诊断、治疗和预后的判断。功能代谢组学是传统代谢组学概念的深化和延伸，采用非靶向和靶向代谢组学分析方法，对不同的生物样本（如血、尿、组织、粪便等）进行分析，从而发现与特定疾病表型密切相关的代谢物差异和代谢通路变化，进一步结合生物学研究，探索代谢物功能和疾病的发生发展机制，发现相关靶点并进行功能学验证（见图1）。目前，功能代谢组学已成为研究生命活动发生发展机制、药物靶点发现等的有效手段。
本文将介绍非靶向和靶向代谢组学及其相关技术，并重点以实例说明代谢组学在药物靶点发现中的应用。
1 非靶向代谢组学
非靶向代谢组学是在有限的相关研究和背景知识的基础上，对整个代谢组进行系统、全面的分析，获取大量代谢物的数据，并对其进行处理，从而找出差异代谢物的一种研究方法。目前，非靶向代谢组学分析在生物标志物的发现、疾病的诊断和机制研究等方面应用广泛，并且为解决一些疾病机制研究的瓶颈问题提供了新的思路和方向。
1.1 基本流程
1.1.1 样本的采集、前处理与分析
样本的采集是代谢组学研究的初始步骤也是最重要的步骤之一，常用于代谢组学分析的样本包括血浆、尿液、各种组织及细胞、细胞器等。代谢组学研究要求严格的实验设计，足够大的样本量可有效减少因生物样本个体差异造成对分析结果的影响，从而得到有统计学意义的数据。
样本前处理的目的是从成分复杂的生物样本中提取出被分析物，减少其他成分对测定结果的干扰，也是影响代谢组学研究结果的关键因素。常用的样本前处理方法包括固相萃取、液液萃取、超临界流体萃取、加速溶剂萃取、蛋白质沉淀、差速离心等。
使用单一的分析技术往往不能满足代谢组学的分析要求。因此，代谢组学常需要多种分析手段的结合。近年来，核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）以及毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）已被广泛应用于代谢组学的研究中。分析手段的进步与代谢组学的发展密不可分，是代谢组学学科发展的主要推动力之一。
1.1.2 数据处理
代谢组学数据需要通过分析和比较找出差异代谢物。常用的数据分析方法包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares projection to latentstructuresdiscriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal projections to latent structuresdiscriminantanalysis，OPLS-DA） 等。应根据实际情况选择适宜的分析手段，从而得到可信的分析结果，同时还需结合t 检验和变量权重重要性排序（variableimportance in projection，VIP）值筛选差异性代谢物，一般认为同时满足P 小于0.05 和VIP 值大于1.0 的变量为有差异的代谢物。
随着代谢组学分析技术日渐成熟，各种代谢组学数据库和处理软件也越来越多（见表1）。根据不同的分析方法，可以在不同的数据库里对化合物谱图进行归属，从而得出差异代谢物的化学结构和名称。在药物靶点的发现过程中，往往需要进行进一步的机制研究，此时可利用KEGG、Metacyc 等数据库进行代谢通路分析，以便掌握相关的代谢通路并开展后续研究。
1.2 在靶点发现中的应用实例
1.2.1 发现心血管疾病治疗的潜在靶点
氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）的含量升高会引起脂质的异常累积，从而增加罹患心血管疾病的风险。Wang 等在对心血管疾病的研究中，采用非靶向代谢组学分析显示心血管疾病患者血浆内TMAO 的含量明显升高。从食物中摄取的胆碱类物质能在肠道菌群中胆碱-三甲胺（TMA）裂解酶的作用下生成TMA，后者进一步在肝脏经黄素单加氧酶3（flavinmonooxygenase3，FMO3）催化代谢生成TMAO。进一步研究表明，FMO3 过表达转基因小鼠在相同的高胆碱饮食条件下，其血浆内TMAO的含量明显高于野生型小鼠。通过反义寡核氨酸技术沉默FMO3 表达的小鼠，其血浆中TMAO 的含量显著低于对照组，表明FMO3 能通过调节血浆内TMAO 含量进一步影响动脉粥样硬化及其他心血管疾病的发病过程。上述源于代谢组学的研究表明，FMO3 可能成为治疗心血管疾病的潜在靶点。
1.2.2发现神经系统疾病治疗的潜在靶点
在一项对神经性疼痛的病理机制研究中，Patti 等建立了神经性疼痛的大鼠模型，并取大鼠背角、背根神经节、胫神经和血浆进行非靶向代谢组学分析，发现模型组大鼠内源性代谢组显著改变，其中神经鞘脂二甲基鞘氨醇（N，N-dimethylsphingosine，DMS）的水平在患有神经性疼痛的大鼠的脊髓中显著增加。进一步生物学功能验证发现异常增加的DMS 水平可以在大鼠体内诱导疼痛样行为，导致多种炎性细胞因子分泌增加，对神经性疼痛的产生起到关键作用。DMS 作为一种内源性代谢物，其含量与S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性N-甲基转移酶（SAM-dependentN-methyltransferase）的活性密切相关，抑制该甲基转移酶可以作为通过阻断DMS 产生来治疗慢性疼痛的潜在方法，因此该甲基转移酶可能成为慢性疼痛的潜在治疗靶点。
1.2.3发现肿瘤治疗的潜在靶点 Gao 等利用毛细管电泳-质谱技术，对神经胶质瘤样本进行非靶向代谢组学分析，发现瘤组织中的亚牛磺酸含量显著高于癌旁对照组织中的亚牛磺酸，并且与胶质瘤分级（恶性程度）呈正相关。经过分子对接计算机模拟，Gao 等发现亚牛磺酸能够竞争性抑制脯氨酸羟化酶2（prolylhydroxylasedomain-2，PHD2）的催化活性，影响羟基化缺氧诱导因子-1α（hypoxia-induciblefactor 1α，HIF-1α）的降解，促进其入核，从而启动许多与肿瘤相关基因的表达。因此，细胞内亚牛磺酸的含量升高可促进肿瘤的发生发展。研究发现，细胞内亚牛磺酸以胱氨酸为前体物质合成，而胱氨酸需通过胱氨酸/谷氨酸反向转运体（XC-glutamate-cystineantiporter）的转运才能进入细胞，抑制该转运体可以阻断亚牛磺酸的生物合成，从而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。因此，胱氨酸/谷氨酸反向转运体可能可以作为治疗神经胶质瘤的潜在靶点。
在一项急性髓细胞白血病的研究中，Bhanot等利用多种酪氨酸激酶抑制剂对白血病癌细胞株进行处理，对不同处理的细胞株进行非靶向代谢组学分析，发现癌变髓细胞内源性代谢组显著改变，一系列内源性代谢物，如与糖酵解、三羧酸循环、糖原合成等能量代谢相关的代谢物显著改变，其中糖原合成前体UDP-D-葡萄糖水平在癌变细胞株内异常升高。进一步机制研究表明，肿瘤细胞代谢重编程依赖糖原合成途径，进行能量储备。糖原合成酶1（glycogensynthase 1，GYS1）活性异常升高的患者往往预后较差。抑制GYS1 不仅降低糖酵解通量，而且导致肿瘤细胞生长受到抑制。新的靶向治疗策略可以靶向抑制GYS1，从而影响肿瘤细胞能量代谢和生长，故GYS1有望成为新的治疗靶点
2 靶向代谢组学
靶向代谢组学是按照代谢组学的原理和思路，只对有限的几个或几类与生物学事件相关的代谢物进行分析和研究的方法。通常在通过非靶向代谢组学发现差异代谢物之后，再利用靶向代谢组学进行进一步系统的确证。近年来新发展起来的糖组学、脂质组学等也属于靶向代谢组学的范畴。与非靶向代谢组学相比，靶向代谢组学在分析上更具有针对性，与非靶向代谢
组学优势互补，是代谢组学的重要组成部分。
2.1 基本流程
2.1.1 样本的采集、前处理与分析
靶向代谢组学与非靶向代谢组学分析所用的样本类型相似。但在样本前处理方面，因靶向代谢组学更具有针对性，基于目标代谢物或代谢组，在提取方法的选择上可能与非靶向代谢组学存在一定的差别。例如，进行脂质组学研究是以提取出更多脂质为目的，所以选用的溶剂多对脂质具有较好的溶解能力，与一般代谢组学研究选用的溶剂差别较大，提取方法上也存在较多不同。靶向代谢组学与非靶向代谢组学所采用的分析仪器基本相同。
2.1.2 数据处理
靶向代谢组学只重点研究已知可能具有生物学效应的几种或几类代谢物，因此其数据处理相比于非靶向代谢组学更为简单方便。其数据处理方法和使用的数据库与非靶向代谢组学相似，但针对某类代谢物，如糖类和脂质组，通常还有LipidMaps、LipidBank等特定的数据库。
2.2 在靶点发现中的应用实例
Marien 等对正常和肝脏鳞状细胞瘤组织样本进行了靶向磷脂的脂质组学分析。结果发现，癌症组织中长链酰基磷脂的含量显著高于正常组织。进一步研究发现，癌症组织中长链酰基磷脂含量的增加与酰基链延长酶（acyl chain elongases，ELOVLs）有关。筛选后发现，ELOVL6 与癌症组织中磷脂酰基链的延长关系最为密切。ELOVL6 被抑制后能够显著降低鳞状细胞瘤细胞的集落形成能力；同时，动物实验表明其被抑制后会显著减慢皮下移植瘤的生长。说明ELOVL6 能通过调节长链酰基磷脂的含量影响鳞状细胞瘤的发生和发展，从而可以作为鳞状细胞瘤治疗和药物研发的潜在靶点。
Nomura 等对黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌等多株肿瘤细胞的蛋白组学进行研究，发现一种脂肪分解酶单酰基甘油脂肪酶（monoacylglycerol lipase，MAGL）表达较正常组织和细胞异常升高，该酶的生物学功能主要是分解脂肪释放出游离的脂肪酸，通过脂肪酸氧化等途径进行能量供应。研究人员进一步对肿瘤细胞株和癌变组织进行脂质组学研究，发现多种游离脂肪酸异常升高，肿瘤侵袭、转移的关键信号分子，如溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acids，LPA）和前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）等的表达也异常升高。一方面，抑制MAGL 的活性在降低癌变组织与细胞中游离脂肪酸的同时，癌细胞的转移、侵袭能力也受到影响；另一方面，过表达MAGL 或通过高脂饮食大量摄入外源脂肪酸，均会提高肿瘤的恶性程度和侵袭性。因此，MAGL 活性升高可促进癌细胞更有效率地从中性脂质中分解游离的脂肪酸用于能量供给。通过蛋白质组学和靶向代谢组学的研究，发现MAGL 可作为抑制癌细胞能量代谢的有效靶点。
3 非靶向和靶向代谢组学结合在靶点发现中的应用
非靶向和靶向代谢组学各有优势和不足。非靶向代谢组学作为一种无偏向的代谢组学分析，样品处理简便，能全面系统地反映生物样本的代谢组特征；但是其线性范围有限，重复性较差，代谢物确证复杂。靶向代谢组学线性范围宽，具有较好的重复性和敏感性，代谢物确证简单；但需事先了解被分析物质的相关信息，是一种有偏向的代谢组学分析。二者结合可作为差异代谢物的发现和准确定量的有力工具，在靶点发现的过程中发挥重要作用。因此，现在越来越多的研究将2种手段相结合，以期得到更准确的信息和实验结果。
3.1 发现肿瘤治疗的潜在靶点
异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）已被证明与多种脑肿瘤相关，其突变会引起酶功能发生明显变化，失去催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）的能力。在一项神经胶质瘤的研究中，Dang 等使用IDH1 突变和未突变的U87MG 恶性胶质瘤母细胞进行非靶向代谢组学分析，结果发现IDH1 突变后的细胞中，2-羟基戊二酸（2-hydroxyglutarate，2-HG）的含量明显高于未突变的细胞。之后用人类神经胶质瘤样本进行靶向代谢组学分析作为验证，主要靶向分析α-KG、2-HG 和三羧酸循环中的相关代谢产物。结果发现IDH1 突变型样本中α-KG 的含量略小于野生型样本，但不存在显著性差异；而2-HG 的含量在两组之间存在显著差异；三羧酸循环中的相关代谢产物在野生型和突变型样本之间不存在显著差异。进一步研究表明，IDH1 发生突变后产生一种新的能力，即催化α-KG 生成2-HG，而2-HG 与α-KG结构相似，高浓度的2-HG 会抑制α-KG 依赖性的酶的活性，从而引起染色质的甲基化以及细胞增殖，诱发肿瘤。目前已研制出突变型IDH1 抑制剂AGI-5198，经实验证明其具有抗肿瘤作用，能显著抑制2-HG 的产生。
3.2 发现糖尿病治疗的潜在靶点
Prentice 等在对妊娠糖尿病的研究中，通过非靶向和靶向代谢组学研究揭示妊娠糖尿病患者血浆内源性代谢组显著改变，进一步筛选发现脂肪酸代谢物3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸（3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropanoicacid，CMPF）水平显著上升。机制研究表明，CMPF 降低β 细胞ATP 生成，影响其线粒体功能，导致β 细胞损伤，胰岛素分泌下降，患者糖耐量降低，最终诱发糖尿病。研究人员进一步发现抑制有机阴离子转运蛋白-3（organic anion transporter3，OAT-3）可阻断CMPF 转运进入β 细胞使其免受损伤，表明OAT-3 可作为调控β 细胞功能的潜在靶点。
3.3 发现治疗缺血再灌注损伤的潜在靶点
缺血再灌注损伤是指缺血的器官恢复血流后，组织器官的损伤反而加重的现象。这种组织损伤被认为主要是由于先前被剥夺血液供应的组织区域氧化应激和过量活性氧簇（ROS）蓄积所造成。Chouchani 等对缺血再灌注小鼠模型的肝、肾、脑、心脏4 个组织进行靶向和非靶向代谢组学分析，发现线粒体能量代谢重要中间体琥珀酸水平在缺血再灌注小鼠组织中异常升高。进一步机制研究表明，缺血组织中琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase, SDH）活性异常升高导致琥珀酸蓄积，使得线粒体电子呼吸链复合物Ⅰ电子正向流动受阻，ROS 过量蓄积，线粒体功能显著降低，最终导致严重的组织损伤。进一步功能验证实验发现，建立小鼠缺血再灌注模型，对SDH 的药理性抑制可以有效地减少缺血再灌注组织区域线粒体ROS 蓄积，缓解其所造成的组织损伤。这些结果表明，SDH 可能是治疗缺血再灌注损伤的潜在靶点，其抑制剂开发可能成为新的治疗途径。
4 结语与展望
非靶向和靶向代谢组学在靶点发现和机制研究等方面有非常大的优势，二者在心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤等疾病机制研究及靶点发现方面发挥了重要作用（见表2）。但是，代谢组学为系统生物学所提供的信息仅限于代谢物，并不足以全面解决复杂的生物学问题。因此，有必要对研究对象进行多组学的全面研究，整合各种高通量的组学数据，充分发掘这些数据中的生物学意义，才能全面阐释各种生物学事件的本质。同时，可以通过构建代谢网络和代谢流变化的数学模型，结合细胞生物学和动物模型的数据和知识，在生物学水平上进行分子功能学验证，最终阐明生命活动及生理病理机制，发现前景良好的药物靶点。
可见，随着分析技术和数据处理技术的进步和发展，代谢组学结合其他多组学数据，将为疾病研究和药物靶点发现作出更突出的贡献。
【专家介绍】 毕惠嫦：博士，中山大学药学院教授、博士生导师、副院长。1997 年毕业于中国药科大学英语药学专业（1993—1997 年）；2007 年毕业于中山大学药学院（2002—2007 年），获药理学博士学位。2011—2012 年在美国国立卫生研究院作访问学者。目前担任中国药理学会临床药理学专业委员会副秘书长 / 常委、广东省药理学会治疗药物监测专业委员会副主任委员、药物筛选与评价专业委员会常务委员、药物毒理专业委员会委员、广东省执业药师协会第三届理事会理事。担任 Journal of Biochemical and Molecular Toxicology、Chinese Medicine、《中国生化药物杂志》编委，《药学学报》及 Acta Pharmaceutica Sinica B 青年编委。毕惠嫦教授研究方向为代谢调控，专注于研究内外源物代谢调控对疾病及临床用药的影响。主持国家省部市各级课题 20 多项，已发表中英科研论文 100 多篇，其中 SCI 科研论文 70 多篇，主编并出版专著 2 部，参编 5 部。获2014 年中国药理学会 -Servier 优秀青年药理学工作者奖，获 2015 年国家自然科学优秀青年科学基金。
●感谢您阅读《药学进展》微信平台原创好文，也欢迎各位读者转载、引用。本文选自《药学进展》2017年第4期。
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