今天要给大家剖析的这篇文章源自中山大学第一附属医院耳鼻喉科医院陈德猛团队，发表于影响因子14.7分的Nature子刊Nat Commun 上。文章聚焦的核心问题，是在抗 CD276 的抗体 α - CD276耐药进程中，巨噬细胞的浸润情况以及T细胞的耗竭现象，本质上探讨的是耐药过程里肿瘤细胞、巨噬细胞与T细胞之间千丝万缕的 “交流”，也就是所谓的 Crosstalk。
开篇，研究者们采用单细胞测序技术，对α - CD276用药后的小鼠模型展开深入分析。下面呈现的这个 UMAP 图，正是单细胞测序的成果结晶。它以基因表达作为多维度的关键主成因，经过复杂的降维处理，最终转化为我们眼前这般直观的 2D 图形，借此实现对具有不同基因表达特征的细胞进行精准分簇剖析。UMAP 和 tSNE 的底层原理如出一辙，要是您对这部分内容感到陌生，不妨去翻阅《列文虎克读文献》以及《夏老师带你读文献》，里面有详尽阐释。在实验设计上，他们依据小鼠形成肿瘤的大小，巧妙地将用药小鼠划分为对照组、敏感组和耐受组。一番研究下来，发现相较于耐药组与对照组，敏感组小鼠样本中的CD8+ T细胞以及CD8+ GZMB+ T细胞浸润程度显著提升。
紧接着，研究者们将目光锁定在耐受组与敏感组之间，还有 Scissor + 细胞（这类细胞代表着与目标表型呈现正相关的细胞亚群，着其实对于课题的推理而言，就是从归纳法的米勒五法中的求同法，两者之间的关联性，就建立在共同点上，不清楚米勒五法的话，可以去看看《列文虎克读文献》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）的差异基因分析环节。他们成功挖掘出差异基因中的 ITGB6 极有可能深度参与了 α - CD276 耐药过程。新发现催生新疑问，如何进一步论证这一猜想呢？研究者们率先采取敲减手段，以此探究 ITGB6 与 α - CD276 耐药之间的内在关联。
具体而言，他们通过敲减 ITGB6，细致观察 α - CD276 治疗耐药状况的变化，以此验证 ITGB6 是否为介导 α - CD276 治疗耐药的关键基因。这一验证流程，实则遵循柯霍氏法则的精髓要义，要是对柯霍氏法则一知半解，可以去研读一下《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》以及《轻松的文献导读》，定能拨云见日。果不其然，敲除 ITGB6 后，小鼠 HNSCC（头颈部鳞状细胞癌）中的 α - CD276 耐药性得到有效缓解，与此同时，CD8 + T 细胞以及 CD8 + GZMB + T 细胞的浸润数量显著增多。
再将视野拓宽，与对照组小鼠相较，ITGB6 敲除的小鼠体内，MoMΦDC（单核细胞 / 巨噬细胞 / 树突状细胞）和 γδT 细胞所占百分比呈现下降趋势，而中性粒细胞、CD8 + T 细胞以及 CD4 + T 细胞的比例则逆势上扬。借助单细胞测序中配体受体之间的紧密关联性分析，研究者们察觉到ITGB6 肿瘤细胞与 MoMΦDC 之间的交互活动最为频繁。当 ITGB6 被成功敲除后，这些 MoMΦDC 中，PF4 + 的巨噬细胞与肿瘤细胞之间的 Crosstalk 明显减弱。研究者们顺势迭代假设（科研课题的持续推进，往往建立在对已有成果以及既有知识信息的深度剖析之上，进而实现假设的迭代升级，要是您对假设和假设迭代概念模糊，可以去研读《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》以及《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列），大胆推测 ITGB6 + 肿瘤细胞大概率与 PF4 + 的巨噬细胞存在相互作用。
沿着这条线索深入探究，研究者们进一步聚焦 PF4 + 巨噬细胞展开精细分析。他们发现，一旦 PF4 + 巨噬细胞比例攀升，患者的存活率便会随之降低，同时 CD8 + T 细胞的浸润程度与杀伤潜能也会大打折扣。
深入挖掘后得知，ITGB6 + 肿瘤细胞与 PF4 + 巨噬细胞之间的相互作用，是由 CX3CL1 - CX3CR1 这般的配体受体相互协作引发的。从逻辑推理层面看，如果阻断 CX3CL1 - CX3CR1 这个关键轴能够有效抑制肿瘤细胞 α - CD276 耐药性的滋生，那么便可推断 ITGB6 + 肿瘤细胞与 PF4 + 巨噬细胞之间的互作就是肿瘤细胞 α - CD276 耐药性的核心症结所在。这属于典型的充分条件假言推理，在推理进程中，唯有通过肯定前件或者否定后件的方式，才能获取可靠结论，要是对肯定后件逻辑谬误认知不足，可以去研读《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》以及《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列。果不其然，研究者们使用 α - ITGB6、α - CX3CL1 和 α - CX3CR1 成功阻断 CX3CL1 - CX3CR1 后，细胞 α - CD276 的耐药性得到切实抑制，此处运用的正是肯定前件的推理策略，有力证实了 ITGB6 肿瘤细胞对 α - CD276 的耐药性，确是由 CX3CL1 - CX3CR1 轴从中斡旋。
问题接踵而至，PF4 + 巨噬细胞究竟会对肿瘤的微环境施展何种影响呢？研究者们马不停蹄，进一步深挖单细胞测序结果，探寻可能与 PF4 + 巨噬细胞存在关联的其他细胞的配体受体相关性。结果令人瞩目，在 ITGB6 敲除的肿瘤样本中，PF4 + 巨噬细胞与 CD8 + T 细胞之间的 CXCL16 - CXCR6 相互作用显著衰减，换言之，在 ITGB6 + 肿瘤细胞的刺激下，PF4 + 巨噬细胞大概率是借助 CXCL16 - CXCR6 轴，对 CXCR6 + T 细胞施加影响。
不仅如此，研究者们还发现 ITGB6 敲除能够降低 PF4 + 巨噬细胞中 NFKB1 的磷酸化水平（这里的 NFKB1 磷酸化，实则是 NFκB 信号通路中，入核与 p65 结合的 p50 发生的变化，要是对 NFκB 信号通路生疏，可以去翻阅《信号通路是什么鬼？》系列资料），进一步探究得知，p50 具备结合并启动 CXCL16 转录的能力。尤为引人注目的是，额外添加 CXCL16，竟然会促使 α - CD276 耐药性水涨船高。通过 PF4 + 巨噬细胞和 T 细胞的共培养实验发现，在低密度条件下，PF4 + 巨噬细胞与 CD8 + T 细胞的 CXCL16 - CXCR6 轴能够刺激生成 GZMB + CXCR6 + CD8 + T 细胞。而一旦 PF4 + 巨噬细胞比例攀升，也就是 CXCL16 产生浓度提高时，GZMB + CXCR6 + CD8 + T 细胞便会华丽转身，转化为 PD1 + CXCR6 + CD8 + T 细胞。这意味着，过度的 PF4 + 巨噬细胞催生的 CXCL16 刺激，能够推动具有细胞毒性的 CXCR6 + CD8 + T 细胞向具有抑制性的 PD1 + CXCR6 + CD8 + T 细胞转变，进而抑制细胞毒性，诱导 CXCR6 + CD8 + T 细胞走向耗竭。
鉴于 ITGB6 + 肿瘤细胞相互作用的 PF4 + 巨噬细胞，能够凭借 CXCL16 - CXCR6 促使细胞毒性的 CXCR6 + CD8 + T 细胞发生上述转变，研究者们再度开启假设迭代之旅（又是一轮精彩的假设迭代，显而易见，这整篇文章通过持续不断地剖析新成果，周而复始地进行假设迭代，才得以层层推导，拨云见日，这与科研套路式方法学截然不同，不清楚的，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》以及《列文虎克读文献》），大胆假设 ITGB6 + 肿瘤细胞相互作用的 PF4 + 巨噬细胞与抗 PD1 抗体的耐药存在千丝万缕的关联性。果不其然，后续研究证实，ITGB6 的确在一定程度上助长了小鼠对 α - PD1 治疗的耐药性。
总而言之，这篇文章在循序渐进的递推进程中，反复迭代假设，又在斩获新成果之后，稳步推进课题。尤为难能可贵的是，在每一个验证环节，研究者们都力求严谨缜密。好了，今天的分享就暂告一段落，要是您兴致盎然，不妨去品读原文，愿您在科研求知之路上心明眼亮，砥砺前行。
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