Plus深读 | 表观沉默miR-483-3p靶向整合素β3促进EGFR突变型NSCLC获得吉非替尼抗性和EMT

原文链接：

http://www.nature.com/articles/s41388-018-0276-2

所有携带EGFR突变的肺癌病人不可避免地对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI）产生抗性，其中，多达30%病人尚不清楚其产生抗性的机制 ¹ 。MicroRNAs (miRNAs)是一类在人类癌症中普遍失调的小的非编码RNA，与治疗抗性密切相关 ² 。该研究的目标是寻找EGFR突变型非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中涉及EGFR TKI抗性产生的miRNAs。该研究小组首次确定miR-483-3p在吉非替尼（gefitinib）抗性的非小细胞肺癌细胞和组织中显著下调，功能实验证明miR-483-3p通过抑制抗性细胞增殖和促进其凋亡增加吉非替尼抗性的NSCLC的敏感性，抑制迁移和侵袭，深入地分子机制研究发现miR-483-3p的下调通过上调β3整合素激活FAK/Erk信号通路，而吉非替尼（gefitinib）抗性的NSCLC细胞中miR-483-3p的下调是由于在其启动子高甲基化，该研究发现了NSCLC中EGFR TKI抗性获得的新机制，为临床miRNAs辅助治疗提供了新靶标。

一、主要材料和方法

1，  人非小细胞肺癌细胞系

（1）正常NSCLC细胞系

①HCC827；②H1975；③A549；④H292；⑤H1299；⑥PC9；

（2）吉非替尼抗性NSCLC细胞系3：

①HCC827GR；②PC9GR；

2，  实验方法

（1）荧光定量PCR；

（2）Western blot；

（3）细胞转染；

（4）免疫组化；

（5）CCK8实验：检测细胞活性；

（6）Edu实验：检测细胞增殖；

（7）荧光素酶报告实验：用于确定miRNAs对于靶基因是否存在直接调控作用；

（8）肿瘤动物模型构建：

①方法I：背部两侧皮下注射NSCLC肿瘤细胞，分别给予药物和对照治疗，通过测量肿瘤体积和重量评估药物作用；

②方法II：尾静脉注射稳定表达荧光素酶的NSCLC细胞，通过活体成像观察肿瘤转移情况，评估药物作用。

二、实验结果

1，miR-483-3p在吉非替尼抗性NSCLC中显著下调

该研究小组首先构建吉非替尼抗性的HCC827GR和PC9GR细胞系，并通过miRNA chip分别分析这两株细胞系与其对应吉非替尼敏感性的HCC827和PC9细胞系中差异表达的miRNAs，发现有15个miRNAs显著上调，而11个miRNAs显著下调，其中miR-483-3p是下调最多的miRNA，因此，该研究小组确定miR-483-3p作为研究对象，如图1A和1B所示，miR-483-3p在PC9GR和HCC827GR细胞系中显著下调。该研究小组进一步构建了吉非替尼抗性肿瘤动物模型，如图1C所示，在吉非替尼治疗50天左右，NSCLC肿瘤对其产生抗性，再次开始生长，同时分离吉非替尼抗性的肿瘤组织和吉非替尼敏感性的肿瘤组织并提取RNA，通过荧光定量PCR发现，miR-483-3p在吉非替尼抗性的肿瘤组织中显著下调（如图1D）。因此， miR-483-3p在体内和体外的吉非替尼抗性NSCLC中都显著下调。

图1 miR-483-3p在EGFR突变的肺癌中调控吉非替尼抗性

为进一步确定miR-483-3p在吉非替尼抗性中的作用，该研究小组分别在HCC827GR和PC9GR细胞系中转染miR-483-3p mimic，并通过CCK8实验检测细胞活性，如图1E和1G所示，过表达miR-483-3p显著抑制细胞活性；而在HCC827和PC9细胞系中转染miR-483-3p inhibitor，抑制miR-483-3p后增强细胞活性（如图1F和1H）。此外，在吉非替尼抗性的肿瘤内注射miR-483-3p mimic显著抑制肿瘤生长（如图1I）。 因此，miR-483-3p在NSCLC的吉非替尼抗性获得中扮演着重要的角色。

2，miR-483-3p在体内和体外都抑制NSCLC细胞增殖和促进细胞凋亡

为确定miR-483-3p是否抑制增殖或者促进凋亡，该研究小组通过转染调节NSCLC细胞内miR-483-3p的表达水平，进而通过Edu实验和CCK8实验检测细胞增殖，并通过流式细胞术和Western blot检测凋亡的marker（Caspase3和RARP）。如图2A和2B所示，在HCC827GR细胞中转染miR-483-3p mimic后，细胞增殖减少，细胞活性降低，与此一致的是，在在HCC827细胞中转染miR-483-3p inhibitor后，细胞增殖增加，细胞活性提高，因此， miR-483-3p抑制细胞增殖 。如图2E，流式细胞术显示，在HCC827GR细胞中过表达miR-483-3p，细胞凋亡比例增加，而在HCC827细胞中抑制miR-483-3p，细胞凋亡比例降低，weastern blot显示，在HCC827GR细胞中过表达miR-483-3p，剪切的RARP和caspase3增加，而在HCC827细胞中抑制miR-483-3p，剪切的RARP和caspase3降低，因此， miR-483-3p可促进细胞凋亡。

图2 在吉非替尼抗性细胞中miR-483-3p抑制细胞增殖和促进细胞凋亡

为进一步确定在体内miR-483-3p的作用，该研究小组将HCC827GR细胞注射在裸鼠皮下背部两侧，分别给予miR-483-3p mimic和阴性对照进行治疗，如图2G所示，过表达miR-483-3p显著抑制肿瘤细胞生长。此外，分别对吉非替尼抗性的HCC827GR肿瘤组织和吉非替尼敏感性的HCC827肿瘤组织中miR-483-3p mimic和阴性对照组样本进行免疫组化，如图2H和2I，miR-483-3p过表达降低Ki67表达和促进剪切的Caspase3表达，即 miR-483-3p在体内抑制NSCLC细胞增殖和促进细胞凋亡。

3，  miR-483-3p抑制EMT表型

在肺癌病人中，EMT与获得性EGFR TKI抗性密切相关 ⁴ ，相似地，EGFR突变的NSCLC细胞在体外慢性的EGFR TKI处理后也可能经历EMT ⁵ 。为了确定在NSCLC吉非替尼抗性获得时miR-483-3p是否与EMT相关，该研究小组通过在NSCLC细胞中调节miR-483-3p的表达，通过Western blot和免疫荧光检测了EMT相关的marker，如图3A，在HCC287细胞中，抑制miR-483-3p表达促进Vimentin、Snail、Zeb1表达，抑制E-cadherin、β-catenin表达，而在HCC827GR细胞中过表达miR-483-3p与之相反，这说明miR-483-3p在HCC827细胞中抑制EMT表型，与此一致的是，在PC9和PC9GR中也是如此（如图3B）；此外，在HCC827细胞中，抑制miR-483-3p促进Vimentin表达，抑制E-cadherin表达，而在HCC827GR细胞中，过表达miR-483-3p抑制Vimentin表达，促进E-cadherin表达（如图3C）， 因此，miR-483-3p在NSCLC细胞中能逆转EMT表型 。为进一步确定在体内肿瘤miR-483-3p与EMT的关系，分离了吉非替尼抗性的NSCLC肿瘤组织（吉非替尼治疗6~8周）和吉非替尼敏感性的NSCLC肿瘤组织（生理盐水治疗1周），如图3D所示，在吉非替尼抗性的NSCLC肿瘤组织中，E-cadherin显著下调，而Vimentin显著上调，而在吉非替尼敏感性的HCC827肿瘤组织中，过表达miR-483-3p促进E-cadherin表达，抑制Vimentin表达，同样的在吉非替尼抗性的HCC827GR肿瘤组织中，过表达miR-483-3p促进E-cadherin表达，抑制Vimentin表达，因此， miR-483-3p在NSCLC肿瘤组织中能逆转EMT表型。

图3 miR-483-3p在吉非替尼抗性细胞中逆转EMT

4，miR-483在体外抑制NSCLC细胞迁移和侵袭而在体内抑制NSCLC转移

在肿瘤发生发展中，EMT能赋予癌细胞侵袭和转移的能力 ⁶ 。该研究小组通过transwell实验检测了miR-483-3p在NSCLC细胞迁移和侵袭中的作用，如图4A和4C所示，在PC9中，抑制miR-483-3p促进PC9细胞迁移和侵袭，而在PC9GR中，过表达miR-483-3p抑制PC9GR细胞迁移和侵袭，同样地，在HCC827细胞中，抑制miR-483-3p促进HCC827细胞迁移和侵袭，而在HCC827GR中，过表达miR-483-3p抑制PC9GR细胞迁移和侵袭（如图4B和4D）， 因此，在体外，miR-483-3p抑制NSCLC细胞迁移和侵袭 。接下来，该研究小组通过尾巴注射稳定表达荧光素酶的HCC827GR细胞构建肿瘤转移模型，过表达miR-483-3p显著肿瘤转移（如图4E）， 因此，在体内，miR-483-3p抑制NSCLC转移。

图4 miR-483-3p抑制NSCLC迁移和侵袭

5，整合素β3是miR-483-3p直接的功能靶标

为深入研究miR-483-3p在NSCLC吉非替尼抗性中的分子机制，该研究小组通过miRWalk（http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/）预测了含有miR-483-3p的3’ UTR结合区域的基因， 发现编码整合素β3的ITGB3基因是miR-483-3p的潜在靶基因。 该研究小组首先检测了吉非替尼抗性和敏感性的NSCLC细胞中的表达情况，如图5A所示，ITGB3在吉非替尼抗性的HCC827GR和PC9GR中显著上调。接着，该研究小组根据预测的ITGB3的3’UTR中miR-483-3p的结合位点，设计了3种不同的突变体（如图5B）并构建荧光素酶重组子，在HEK293细胞中转染荧光素酶重组子和miR-483-3p mimic，然后检测荧光素酶活性，发现突变M1和M3后基本不影响荧光素酶活性，而突变的M2影响荧光素酶活性，从而确定，M2突变对应的序列不是miR-483-3p的结合位点，而M1区域对应的序列是miR-483-3p的结合位点（如图5C），因此， ITGB3是miR-483-3p的直接靶基因。 然后，该研究小组分别在吉非替尼敏感性的HCC827和PC9细胞以及吉非替尼抗性的HCC827GR和PC9GR中转染野生型的ITGB3的荧光素酶重组子，如图5D，与吉非替尼敏感性细胞相比，荧光素酶活性在吉非替尼抗性细胞中显著增强，进一步证明 在NSCLC中，ITGB3是miR-483-3p的直接靶基因。 接着，该研究小组在HCC827细胞和PC9细胞中，抑制miR-483-3p后显著增加ITGB3表达，而在HCC827GR和PC3GR细胞中，过表达miR-483-3p显著抑制ITGB3表达，进一步证明miR-483-3p调控ITGB3表达。接下来，该研究小组在HCC827、PC9、H1975、 H292、A549和H1299这六种NSCLC细胞中检测了miR-383-3p和ITGB3的表达水平，并进行了相关性分析，如图5F，R2是0.8547，相关性很大。最后，该研究小组分别在HCC827和HCC827GR肿瘤组织中注射miR-483-3p mimic，结果如图5H，过表达miR-483-3p抑制ITGB3表达。因此， 整合素β3是NSCLC中miR-483-3p的靶基因。

图5 整合素β3是miR-483-3p的直接靶标

为进一步确定整合素β3与miR-483-3p的功能相关性，该研究小组在吉非替尼抗性的HCC827GR细胞中，共转染miR-483-3p mimic或阴性对照和整合素β3过表达载体LV-ITGB3（ITGB3）或LV-GFP（LV），通过Edu染色、transwell实验、EMT marker免疫荧光以及流式细胞术检测整合素β3能否挽救miR-483-3p诱导的表型，如图6A，Edu染色显示，在转染miR-483-3p mimic时，过表达整合素β3能挽救miR-483-3p导致的细胞增殖抑制表型，这与阳性细胞统计是一致的（如图6B）；EMT marker免疫荧光显示，在转染miR-483-3p mimic时，过表达整合素β3抑制E-cadherin表达，促进Vimentin表达，即整合素β3促进EMT表型，能挽救miR-483-3p对EMT的逆转，这与Western blot结果是一致的（如图6E）；Transwell实验显示，在转染miR-483-3p mimic时，过表达整合素β3能挽救miR-483-3p导致的侵袭抑制表型，这与细胞统计是一致的（如图6C）。如图6D，在转染miR-483-3p mimic时，过表达整合素β3能部分挽救miR-483-3p导致的促凋亡表型，这与细胞活力检测一致（如图6F）。因此， 整合素β3是miR-483-3p的功能靶基因，能挽救miR-483-3p诱导的增殖和侵袭抑制、EMT逆转和促凋亡等表型。

图6 过表达整合素β3挽救miR-483-3p诱导的表型

6，miR-483-3p通过下调整合素β3抑制FAK/Erk信号通路

整合素在许多生物学进程中起着关键的作用，包括药物抗性和肿瘤转染 ⁷ ，而FAK信号通路是整合素调控的关键信号通路，因此，该研究小组首先考虑通过western blot检测miR-483-3p是否影响FAK信号通路及下游分子，如图7A和7B，在吉非替尼抗性细胞HCC827GR和PC9GR中，过表达miR-483-3p下调FAK磷酸化和Erk磷酸化，即抑制FAK/Erk信号通路，而在吉非替尼敏感性性细胞HCC827和PC9中，抑制miR-483-3p上调FAK磷酸化和Erk磷酸化，即激活FAK/Erk信号通路，因此， miR-483-3p能抑制FAK/Erk信号通路 。相似地，在吉非替尼敏感性性HCC827肿瘤和吉非替尼抗性细胞HCC827GR肿瘤内，过表达miR-483-3p抑制FAK磷酸化和Erk磷酸化，因此，miR-483-3p在体内和体外都抑制FAK/Erk信号通路。为进一步确定miR-483-3p在吉非替尼抗性细胞中下调的原因，该研究小组使用5-azacytidine 和地西他滨（decitabine）处理HCC827GR和PC9GR，显著上调miR-483-3p（如图7E），这提示miR-483-3p的下调极可能是有与启动子高甲基化导致的。接下来，该研究小组在HCC827GR细胞中，在5-AZA处理或者不处理的前提下，共转染野生型ITGB3的3’UTR荧光素酶重组子和miR-483-3p inhibitor或阴性对照，结果如图7F所示，仅用5-AZA处理，不转染miR-483-3p inhibitor时，显著抑制荧光素酶活性，而5-AZA处理后，转染miR-483-3p inhibitor时，荧光素酶活性增强，因此，进一步确定miR-483-3p启动子甲基化水平影响其表达水平。与此同时，该研究小组在HCC827GR细胞中，在5-AZA处理或者不处理的前提下，转染miR-483-3p inhibitor或者阴性对照，Western blot分析发现，仅5-AZA处理显著抑制ITGB3表达，FAK磷酸化水平降低，而在5-AZA处理前提下，转染miR-483-3p inhibitor，促进ITGB3表达，FAK磷酸化水平升高，因此，进一步确定miR-483-3p启动子甲基化水平可影响下游靶标分子表达和信号通路。

图7 miR-483-3p下调激活FAK Erk信号通路

7，总结

基于上述研究，如图7H，该研究小组发现， 在EGFR突变型NSCLC产生吉非替尼抗性时，miR-483-3p启动子高DNA甲基化导致其表达下调，增加整合素β3表达，提升FAK/Erk的磷酸化，激活FAK/Erk信号通路，进而促进增殖，抑制凋亡，促进EMT表型，在体促进肿瘤发生转移。

三、讨论和思考

EGFR突变型NSCLC产生EGFR TKI抗性后，限制了这些药物的临床使用和有效性，因此，探索其发生抗性的分子机制是研发对应治疗策略的关键点。该研究小组在本研究中，发现miR-483-3p是EGFR突变型NSCLC产生吉非替尼抗性的关键miRNA，在获得抗性后显著下调并阐明了miR-483-3p的作用和分子机制，这提示我们miR-483-3p有望成为用于治疗或者辅助治疗EGFR突变的NSCLC。本文的创新点如下：

1，  首次确定miR-483-3p在EGFR突变的NSCLC中显著下调；

2，  首次确定整合素β3是miR-483-3p的功能靶标，并介导miR-483-3p诱导的EGFR突变型NSCLC的EGFR TKI抗性获得；

3，  体外和体内实验证明miR-483-3p显著抑制肿瘤生长，并消除其对吉非替尼的抗性，这提示miR-483-3p是肺癌的潜在治疗靶标。

本文详细研究了miR-483-3p在EGFR突变型NSCLC获得吉非替尼抗性中的作用和分子机制并发现miR-483-3p下调是由于启动子DNA的高甲基化， 若能给出miR-483-3p启动子区域的DNA甲基化水平差异的数据，证据会更加充分。 本文的研究思路十分严谨，总结如下：

Step1： 分析正常NSCLC细胞HCC827和PC9与吉非替尼抗性细胞HCC827GR和PC9GR中差异miRNAs ，选取显著差异miRNAs并验证，更重要的是同时检测在体敏感性肿瘤和药物抗性肿瘤中该miRNAs表达差异，确定miR-483-3p在抗性获得时显著下调；

Step2： 功能实验检测miR-483-3p功能

在HCC827和PC9中转染miR-483-3p inhibitor，而在HCC827GR和PC9GR中转染miR-483-3p mimic，检测细胞活力、增殖、凋亡和EMT表型，同时构建相应肿瘤动物模型，检测功能；

Step3： 寻找miR-483-3p靶基因 ：http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/

荧光素酶报告实验验证靶基因，同时检测靶基因整合素β3在正常与抗性NSCLC细胞中表达差异，通过在HCC827和PC9中转染miR-483-3p inhibitor，而在HCC827GR和PC9GR中转染miR-483-3p mimic再次确认miR-483-3p对靶基因的调控，接着挽救实验证明整合素β3能挽救miR-483-3p诱导的表型，确认是功能靶标，同时在体验证；

Step4： 解析靶基因参与的信号通路 （可在靶基因选择时考虑）；

Step5： 阐明miR-483-3p下调是由于启动子DNA甲基化改变 （选择 下调 miRNA可优先考虑，当然也可能涉及组蛋白修饰的改变）