在抗体药物开发过程中细胞株开发是CMC的起点和基础，可以说CMC的大部分工作都是直接或间接与细胞株有关。药物上市以后一般情况下同一个细胞株将伴随产品的整个生命周期。 细胞株的好坏直接决定生产成本和产品质量，其重要性不言而喻。细胞株的构建从原理上来说十分简单，无非是把质粒转染到细胞里然后整合到宿主细胞的基因组。但是细胞株的产量和质量千差万别，构建一个适合生产用的细胞株并非是一件容易的事情。
一个好的细胞株有多方面要求：1. 产量高，高的产量直接降低固定投资和单次生产成本。2. 产品质量符合要求。产品质量影响药效和安全性。3. 稳定性。产量和质量在生产传代过程中不应有大的改变。一般认为在60-90PDL产量变化不超过30%是可以接受的。4. 与生产过程的相容性。细胞株需要适合大规模生产放大。5. 合规。细胞株的构建过程应避免接触或使用动物来源成分或其它可能影响安全性的成分， 保证单克隆性（clonality）以及整个过程的实验记录完整。
做为一个细胞株开发平台，不仅仅需要能够开发出好的生产用高产细胞株，设计一个好的流程也很重要。 一个好的细胞株开发平台需要满足： 1. 可有效产生高产细胞株。2. 能够快速获得细胞株以缩短CMC时间，加快药物上临床的时间。3.能够快速获得足量的重组蛋白以进行生产可行性研究及药物体内体外实验。4. 降低工作量。一方面降低人力成本，另一方面也降低人为操作失误的可能性。
本文试图从细胞株构建的各个环节谈一谈这些环节对细胞株的可能影响。
做蛋白表达的人都知道，对细胞株产量影响最大的莫过于蛋白本身的性质。一个好表达的蛋白往往能很容易就拿到高产细胞株。一个蛋白表达容易与否与其结构稳定性有很大关系。结构稳定，容易折叠，没有表面疏水氨基酸的蛋白往往容易表达。细胞株开发人员与蛋白设计人员保持密切沟通，及时反馈非常重要。有时候一两个氨基酸的改变就能大大提高产量。
因为抗体有轻链和重链，我经常被问到是用一个载体还是用两个载体好。从我的体会来说，两种我都用过，也都得到过很高产量的细胞株。如果载体设计得好，两种选择没有优劣之分。有一点需要考虑的是在哺乳动物细胞里表达抗体轻链的表达量要高于重链，这是因为重链无法单独分泌出来，只有在和轻链结合之后才能分泌，而轻链是可以形成二聚体分泌出来的。如果用单载体系统，需要保证轻链的表达链高于重链。由于在单载体里表达多个蛋白的情况下存在转录干扰（transcription interference）的现象，即前一个蛋白都表达会抑制后面的蛋白表达造成蛋白间表达不平衡，在单载体表达系统里往往把轻链放在重链前面。在双载体系统里则无需考虑轻重链比例问题。细胞会自己选择合适的比例。
载体系统的另一个常见问题是筛选标志基因（selection marker）的选择。筛选标志基因基本上分两类，即抗生素类如neomycin, hygromycin，puromycin, blasticidin, zeocin等抗生素抗性基因。这类筛选标志基因优点是适合任何宿主细胞。缺点是没有基因扩增效应，表达产量往往偏低。另一类是代谢型筛选标志基因，如DHFR（二氢叶酸还原酶）和GS （谷氨酸合成酶）基因。筛选时使用GHT-free或Glutamine-free培养基加DHFR或GS的抑制剂MTX和MSX以增加选择压力。由于MTX/MSX浓度与选择压力有良好的相关性，加上基因扩增效应， DHFR或GS系统往往能拿到表达量比较高的细胞株。这类筛选标志基因通常使用代谢缺陷型宿主细胞如DG44， DXB11。 野生型CHO-K1细胞曾被用于GS系统。近年来通过基因敲除技术获得的CHO-K1 GSKO宿主细胞应用于细胞株开发，一定程度上减少了假阳性细胞株的产生。
DHFR系统一般用MTX逐步加压以获得高表达细胞株。经过基因扩增以后基因拷贝数可达数百甚至上千。因为需要多轮加压，DHFR系统耗时较长，一般在6个月以上。GS系统也可以用MSX加压，但也有些人选择不用MSX加压以求加快速度。GS系统获得的细胞株基因拷贝数较低，一般在几个到几十个拷贝左右。GS细胞株的另一个好处是可以靠无谷氨酸的培养基来保持选择压力，无需另加药物。在seed train放大阶段不需要担心过早撤除抗生素或MTX以后失去选择压力。GS系统的专利原由Lonza垄断，近年来随着专利过期，越来越多的公司开始使用GS系统。
CHO细胞的DNA修复机制受损，细胞在生长过程中对各种突变不能完全修复，而这些突变对细胞可能产生各种不同的影响，这使得CHO细胞具有很强的可塑性。前面谈到的DHFR和GS系统比较容易获得高表达细胞株，一般认为这是选择压力和基因扩增的结果，另一个容易被人忽略的因素就是MTX和MSX对宿主细胞的重塑。由于MTX和MSX都直接或间接抑制核苷酸的合成进而影响DNA合成，它们能引起细胞内大量突变的产生，而某些突变可能对蛋白表达有促进作用。所以有些克隆经过MTX或MSX处理以后产量提高但基因拷贝数并没有太多增加，其原因就是对宿主细胞的重塑作用。
对宿主细胞的重塑作用的一个负面影响就是经过基因扩增的细胞株除了产量增加以外，细胞本身的性状也可能会有比较大的改变。这就是为什么MTX处理过的细胞株性状变化会比较大。这样后面的上游甚至下游工艺开发工作会比较有挑战性。
在蛋白表达历史上曾有很多不同的哺乳动物细胞被用做宿主细胞，包括CHO，HEK293, NS0, BHK等等。CHO细胞由于表达蛋白的翻译后修饰与人类蛋白类似，细胞容易悬浮培养，不容易受病毒感染而受到青睐。宿主细胞的另一个考虑是监管机构的熟悉程度。由于CHO细胞已经积累了几十年大量的使用经验，监管机构已经对其十分熟悉。加上近年来针对CHO细胞开发的培养基和生产工艺日臻完善，现在抗体生产基本上已经是CHO细胞一统天下了。
几个常用的CHO细胞系包括DG44，DUXB11, CHO-S, CHO-K1等。DG44和DUXB1是DHFR缺陷型细胞。由于DHFR系统在早期的流行，DG44是早期常用的宿主细胞。DG44还有DUXB11的一个缺陷是细胞生长比较慢。CHO-S和CHO-K1都是野生型细胞。CHO-K1细胞曾被用于GS系统。由于CHO细胞有内源性GS高表达，在用于GS系统时会有大量假阳性克隆产生。 近年来有多个公司用基因敲除技术获得CHO-K1 GSKO宿主细胞用于细胞株开发（1），包括Lonza的Xceed系统，SAFC的CHOZn，和Horizon Discovery的CHO GS null细胞。Lonza和SAFC是用ZFN技术进行GS基因敲除，Horizon Discovery是用rAAV病毒技术进行GS基因敲除。
宿主细胞提供了重组蛋白产生所需要的能量，原料和转录，翻译，蛋白折叠，翻译后修饰，分泌全过程所需要的酶和功能性分子，因此选择一个合适的宿主对获得高产细胞株十分重要。 不同的细胞系对蛋白表达产量和质量的影响可能很不一样。根据Pfizer的比较，不同细胞系的表达量依次为CHO-K1SV>DG44>CHO-S（2）。Genentech的研究也发现同样的抗体在CHO-K1和DUXB11里有截然不同的表达量（3）。甚至同一个细胞系里不同的克隆对蛋白表达的影响也可能十分不一样。因此筛选一个好的宿主细胞克隆对于得到高产优质细胞株十分重要。
相对于载体，我们对宿主细胞的了解十分有限。宿主细胞对我们来说基本上是一个黑盒子。 近年来技术的发展，包括CHO细胞的全基因组测序，对于我们了解CHO细胞有所帮助，但我们离真正了解CHO细胞还十分遥远。CHO细胞从来源上来说是上皮细胞，不是职业型的蛋白生产和分泌细胞。我相信未来细胞株产量的进一步提高的关键在于宿主细胞的优化，这方面我们还有很长的路要走。
建一个好的细胞株重要，如何建好的细胞株同样重要。由于细胞株开发是CMC的第一步并且占相当部分临床前研究的时间，快速建立一个好的细胞株将有助于药物尽快推进到临床实验阶段。同时由于高产细胞株产生几率很低，筛选一个高产细胞株的过程有如大海捞针，是一个费时费力的过程，如何降低工作量同时保证细胞株产量也是在设计细胞株开发平台需要考虑的问题。
细胞株开发的第一步是把质粒转染进宿主细胞。转染可以用电转或化学转染。转染之后根据载体携带的选择基因在培养基里加抗生素或用GHT-free，Glutamine-free培养基。未有质粒整合的细胞会被杀死。活下来的细胞即成为细胞群（pool）。在理想的情况下，每一个细胞都有携带目标基因和选择基因的质粒整合，也都应该有目标基因的表达。实际上细胞群里的细胞表达量高低不一，很多甚至没有目标基因都表达。其原因有多方面包括目标基因的丢失或沉默。低表达或无表达的细胞往往生长较快，经过一段时间的培养以后便会“劣币驱逐良币”，细胞群的表达量会快速下降（4）。一个解决办法改进载体的设计使目标基因和选择基因紧密偶联比如使用IRES。另一个办法是在载体上加入抗沉默的序列比如insulator, UCOE，MAR, EASE等(5)。还有一个办法是做mini pool，即在转染以后把细胞分到96/384孔板里进行选择。由于在96/384孔板里高表达慢生长的细胞与低表达快生长的细胞共存于一孔的机会大大降低，使得这些高表达的细胞有机会成长起来。做mini pool需要在转染后尽快铺板，一般在一两天之内，时间太长则容易同质化而失去做mini pool的意义。Mini pool的主要缺点是工作量大大增加，时间也要延迟。
得到好的细胞群以后下一步是进行单细胞克隆。根据ICH指导原则，生产用细胞株必须是来自于单个细胞。常用的单细胞克隆方法包括有限稀释法，流式细胞仪单细胞铺板，以及Clonpix。两轮有限稀释法（铺板细胞<0.5 cell/well）是早期常用的方法，其缺点是时间比较长。近年来多孔板自动拍摄仪(主要有CloneSelect Imager，Cellavista，Solentim)广泛应用于记录单细胞克隆过程，可以与有限稀释法或FACS联合使用，成为有力的单细胞性（clonality）证据。最近有些专门用于单细胞铺板的仪器比如Cytena也已经进入市场。Clonpix可以有效地从大量细胞中找出高产克隆，但需要满足clonality的要求必须进行两轮clonpix或一轮clonpix加一轮有限稀释。在单细胞克隆完成之后应当避免导致细胞生存压力增加的操作，比如驯化或增加选择压力。
待96/384孔板里的细胞长成克隆以后进行第一轮高通量克隆筛选，常用方法如HTRF，ELISA，或ForteBio。然后将高表达克隆从96/384孔板移出并逐步放大。第二轮克隆筛选一般采用fed batch的方法，可在摇瓶，转管（spintube）, 或24孔深孔板中进行。筛出的最佳克隆进入小型生物反应器或Ambr进行工艺优化并确定最终克隆，同时进行稳定性测试和建库。克隆的逐步筛选工作十分费时费力，今年来各大药厂都广泛应用自动化设备，提高了很多效率。
整个细胞株开发过程应当有完整实验记录， 包括使用的试剂，培养基，耗材，设备的厂家，型号，批号，有效期等。细胞株从转染开始到筛选出最终克隆的过程包括每个阶段的转换都应该有记录。细胞株的来龙去脉应当清晰准确, 有良好的可追溯性。
如前所述，细胞株开发是一件科学原理上看起来十分简单的事情，但在过去30年里技术上经历了巨大的变化，产量也从100mg/L左右提高到现在的最高>15g/L。本人有幸从事这个行业15年，亲身经历了期间技术上的演变，包括载体，流程，培养基，工艺上的不断优化以及各种新技术设备的应用。我相信未来仍然有许多工作要做，尤其是我们对CHO细胞的理解还非常有限。随着新技术的出现，比如NGS，CRISPR/Cas9，定点整合等，我们对CHO细胞的了解和操控能力都将不断提高。同时随着重组蛋白药物分子结构的不断演变，比如近年来大热的各种双特异性抗体，以及培养工艺的演化，对细胞株开发工作的要求都在不断改变和提高。
本文作者刘大有，曾在安进和默沙东从事生产用细胞株开发工作15年。在安进期间负责开发多个现已上市和即将上市的抗体药物生产用细胞株并创造安进细胞株最高产量记录。同时在新一代细胞株开发技术和细胞株遗传鉴定有多项技术创新。在默沙东工作期间主导默沙东新一代快速高效细胞株开发平台载体设计。现任职于天演药业。于缅因大学和武汉大学获得硕士学位以及武汉大学学士学位。
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1. 原创 | 动物乳腺生物反应器 PK CHO细胞系统: 谁能横刀立马？
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致谢：感谢陈曦对文章的审阅意见。
编辑：王宝龙
华人抗体协会
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