首次发现：外周血中异倍体循环血管内皮细胞CEC

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肿瘤病人外周血循环稀有细胞 (circulating rare cells, CRCs) 主要包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs) 和循环血管内皮细胞 (circulating endothelial cells, CECs)。CECs不仅与血管生成和肿瘤生长、播散有关，还能够作为抗血管生成药物的靶点和疗效评估的标志物。

 CTC的染色体异倍体特征及其临床意义以往已有很多论述，而对于CEC的染色体倍体研究目前还没有任何相关报道。最近，由国际著名的德国 Ludwig-Maximilians 大学医学中心 (LMU) 、上海第一人民医院肿瘤中心及赛特生物 (Cytelligen/Cytointelligen) 密切合作，应用SE-i•FISH^®整合技术，在共同完成的多瘤种、多中心的联合临床实验中首次发现，肿瘤病人体内不仅存在染色体异倍体CTCs (CD31^-/CD45^- ) ，同时也存在着显著数量的染色体异倍体CECs (循环肿瘤血管内皮细胞，CD31⁺/CD45^- )，以及“肿瘤上皮-内皮融合型细胞和癌栓”(tumor epi-endo fusion cells and clusters)。该研究不仅可以帮助人们进一步深入了解CEC在肿瘤血管生成与肿瘤生长、转移过程中的相关性，更重要的是，使人们首次能够有效区分、鉴别肿瘤病人血液中的异倍体CTCs及异倍体CECs这两类完全不同的细胞。在极大地提高了CTC检测的特异性同时，亦可同步对CEC的临床意义，以及CEC与CTC如何相互协同等方面开展深入研究。该研究成果经Nature Biotechnology (自然•生物技术) 编辑部特别推荐，已发表在Scientific Reports杂志上 (Lin et al., 2017 Sci Rep 7:9789)。

染色体异倍体是恶性细胞的最典型特征 (Kops et al., 2005 Nat Rev Cancer 5:773; Gordon, et al., 2012 Nat Rev Genet 13:189)。正常组织中的内皮细胞为二倍体，一般统称为血管内皮细胞；肿瘤组织中的异倍体内皮细胞，定义为肿瘤血管内皮细胞 (tumor endothelial cells, CD31⁺/CD45^- ) (Hida et al., 2004 Cancer Res 64:8249)。循环内皮细胞CEC 在肿瘤血管生成及肿瘤转移过程中具有极其重要的临床意义 (Bertolini et al., 2006 Nat Rev Cancer 6:835)，然而以往对于外周血CEC染色体倍体的鉴别及相关临床意义的研究则一直处于空白。本实验研究人员借助赛特SE-i•FISH^® 及Metafer-i•FISH^® 全自动六通道CRC扫描与图像分析系统的特殊技术优势，对肿瘤病人体内的CTC与CEC进行了系统性的检测、鉴别与比较，首次发现了染色体异倍体循环肿瘤血管内皮细胞CEC的存在。文中大量研究证实，除少部分表达CD31⁺/CD34⁺ (循环内皮祖细胞，CEP) 或CD31⁺/CD146⁺ (成熟CEC) 外，大部分该类细胞具有未曾报道过的特殊蛋白表型CD31⁺/CD34^-/CD133^-/CD105^-/CD146^-/CD45^-。

进一步的研究发现，除异倍体CECs外，某些肿瘤病人体内还存在着异倍体epi-endo融合型肿瘤细胞及癌栓，且该类融合型细胞或癌栓具有迄今为止没有报道过的独特蛋白表型 (CD31⁺/EpCAM⁺/Vimentin⁺/CD45^- )。

进一步的临床对照实验发现，异倍体CECs 不仅存在于所有肿瘤病人体内，66% 受检的正常人群 (n=47) 中也发现了该类细胞。但病人与正常人相比（6 ml 血液），无论异倍体CECs的阳性率 (肿瘤病人vs正常人: 100% vs 66%)，还是人均异倍体CEC 细胞数目 (肿瘤病人vs正常人: 8.8±14.3 vs 2.8±3.6, mean ± SD)，均呈现显著性差异。

异倍体CEC在肿瘤病人与正常人群中的表型差异、功能的异同、以及循环肿瘤CEC在肿瘤生成、转移等过程中的临床意义仍有待进一步深入研究。

异倍体循环肿瘤血管内皮细胞CEC (CD31⁺ ) 与异倍体循环肿瘤上皮细胞CTCs (CD31^- ) 是两类完全不同的细胞，且具有不同的临床与生物学意义。随着本文的发表，人们对这两类细胞的认知日渐清晰，两者绝不能再混为一谈！显而易见，对异倍体CECs与CTCs的有效区分与鉴别，已成为高特异性地准确检测CTC的必要前提！

本文不仅向人们展示了独特的SE-i•FISH^®技术用于同步检测CECs 与 CTCs ，而且也为广大肿瘤界同行提供了研究CTC上多重肿瘤细胞标示物的有效技术平台。借助赛特生物与蔡司、MetaSystems联合开发的Metafer-i•FISH^® 全自动CTC图像扫描与分析系统，5通道双瘤标-iFISH及6通道三瘤标-iFISH将有助于人们研究、检测CRCs上不同肿瘤标示物是如何与染色体倍体相互协同 ，从而在肿瘤转移、耐药、复发等过程中发挥重要作用。

赛特生物CTC差相富集 (Subtraction Enrichment, SE) 与其它阴性富集方法的最大区别之一在于，SE富集避免使用低渗裂解法，而是使用本研究作者发明的特殊离心介质去除红细胞 (Lin et al., 1999 J Cell Biol 145:279; Lin et al., 2009 Mol Neurodegener 4:1)，从而避免了低渗对CRC造成的损伤。本研究对经过SE富集及优化的液态免疫荧光染色 (Lin et al., 2000 PNAS 97:674) 后的肿瘤细胞进行了细胞活性评估。实验结果显示，经过SE富集及免疫染色，无论是肿瘤细胞还是残留的白细胞，均保持了极高的细胞活性，存活率分别为95.3±2% (肿瘤细胞) 及 93±2.1% (白细胞) (mean ± SD)。差相富集过程及本文采用的免疫荧光染色方法对细胞活性的影响微乎其微。

实验结果提示，SE富集CTC后，采用Hoechst标记细胞核，7-AAD 标记坏死细胞 (necrotic cell)，同时结合液态免疫荧光染色，可以为人们提供额外的技术手段，用于观测肿瘤治疗方法对体内CTC或体外培养的肿瘤细胞的杀伤效果，从而达到筛选肿瘤用药及评估疗效的目的。

为了便于人们对赛特生物SE-iFISH的技术路线及各种应用有一个比较清晰的了解，本文将相关信息汇总成流程图如下：

需要特别指出的是，SE富集分离出具有极高生物活性的各种体液来源 (如血液、胸水、腹水、骨髓、尿液、脑脊液、淋巴穿刺等) 的肿瘤细胞可适于原代细胞培养。本文作者与美国加州大学圣地亚哥分校肿瘤中心 (UCSD Moores Cancer Ctr) 的联合实验证明，原代培养的肿瘤细胞纯度在培养过程中明显不断提高，且可反复冻融。这些培养的CTC原代细胞，或克隆化培养的具有不同临床意义的CTC亚类细胞，可用于后续CDX肿瘤动物模型的建立 (Hodgkinson et al., 2014 Nat Med 20:897; Alix-Panabieres et al., 2016 Mol Oncol 10:443) 及肿瘤活细胞标本库的建立。相对于石蜡包埋的病理组织切片，或单纯的血浆蛋白、血浆核酸片段，SE富集得到的各种肿瘤细胞 (包括CTC) 不但具有生物活性，而且包含了完整的肿瘤细胞核酸与蛋白信息，从而为进一步开展肿瘤研究及建立具有真正意义与应用价值的“肿瘤活细胞生物样本库”(Biobank for Viable Tumor Cells) 奠定了坚实基础。

类似于肿瘤的高异质性，不同CTC之间也存在着极大的差异。借助SE-i•FISH^®技术，根据染色体异倍体数目及肿瘤标示物的蛋白表达，对CTC进行亚类分型 (Lin, 2015 Clin Transl Med 4:38)，发现各个亚类的CTC具有不同的临床意义，如肿瘤耐药 (Li et al., 2014 Oncotarget 5:6594)、病人预后 (Li et al., 2015 Chin J Cancer Res 28:579) 等。对于今后开展CTC单细胞分析工作，显然不再是随意挑取检测出的CTC，而是应针对性地挑取与不同临床意义 (如肿瘤转移、耐药、复发等) 密切相关的CTC亚类单细胞。

目前国际上至少有22个多瘤种、多中心的CTC临床实验正在积极进行中 (Wang et al., 2017 Oncotarget 8:1884)。除CTC计数外，这些临床研究更加关注与CTC相关的20个肿瘤标示物及与DTC相关的14个瘤标 (EpCAM, Vimentin, HER2 等) 蛋白表达的临床意义。

随着赛特生物SE-i•FISH^®技术的不断普及应用，人们不仅可以在CTC上联合检测具有特定临床意义的染色体异倍体及各种瘤标蛋白表达，同时还可以对循环肿瘤血管内皮细胞CEC的临床意义进行深入研究。循环肿瘤内皮细胞CEC (Carmeliet & Jain, 2000 Nature 407:249)、肿瘤CEC细胞栓 (Cima et al., 2016 Sci Transl Med 8:345)、CTC癌栓 (Cheung et al., 2016 Science 352:167) 及Vimentin (Tsai & Yang et al., 2013 Genes Dev 27:2192) 在肿瘤形成、转移、耐药、预后、复发等过程中发挥着极为关键的作用。因此，在同一标本上同时完成对CTC与CEC的有效鉴别及检测，不仅极大地提高了CTC检测的特异性，同时可以帮助人们进一步探索CTC与CEC在肿瘤生成、转移等过程中如何不断相互协同，并发挥重要作用。

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