Nature Communications发表华中科技大学生命学院谢尚县教授团队最新研究成果——利用响应芳香族化合物代谢中间体的自动调控系统将木质素高效转化为生物可降解塑料
本研究发现
Ralstonia eutropha
H16的关键调控元件PcaQ对木质素降解中的中心代谢产物原儿茶酸高度敏感。因此，基于微生物对芳香族化合物代谢的“生物漏斗”特性，创新性地构建了一种基于响应芳香族化合物代谢中间体的
HMA
（
自动调控）
系统，有效解除了木质素解聚产物的异质性对微生物代谢造成的限制，实现木质素向可降解塑料的高效转化。
随着生物质精炼技术的快速发展，木质素作为主要副产物之一，其商业化利用率低，多被燃烧发电或直接废弃。将木质素转化为高价值化学品对提升生物精炼经济性和可持续性至关重要。但木质素解聚产物的异质性对其高值转化造成了严重的限制。最近有相关研究表明，通过整合来自不同微生物的生物元件，为木质素的降解与转化提供了新策略。
此外，发展生物可降解塑料代替目前的传统石油基不可降解塑料已成为国际发展战略共识。将木质素转化为生物聚酯（如聚羟基丁酸酯PHB）的转化过程需微生物同时具备芳香族化合物
代谢
和合成生物聚酯的能力。
R. eutropha
H16因其代谢多样性、高密度发酵能力和高聚酯积累能力成为生物聚酯生产模式菌株之一。利用底物作为诱导剂触发所需底物代谢基因表达的自调控系统，具有无需添加外部诱导剂、并能更智能、更精确地调节响应基因的表达来减轻细胞不必要的代谢负担等优点。因此，依托微生物对芳香族化合物代谢的“生物漏斗”特性，以响应中心代谢物的调控元件为核心构建调控枢纽，可实现多元底物代谢的自动调控，是解决木质素底物代谢自调控挑战的理想策略。
赋予
R. eutropha
H16代谢芳香族化合物的O-去甲基化的能力
R.
eutropha
H16可以代谢各种类型的物，如果糖、甘油和芳香族化合物等。然而木质素解聚产物中含有不同结构的芳香族化合物，其大多数对微生物的生长起抑制作用。因此，分析
R. eutropha
H16对LDAs（木质素衍生的芳香族化合物）组分的代谢能力，将有助于更全面地定位其在木质素增值过程中的作用。
实验结果显示，
R. eutropha
H16在代谢芳香酸类物质能力比较强，且所有芳香族底物在48小时内被完全消耗。其对LDAs展现出了广泛的代谢能力和适应性。这一发现为进一步优化
R. eutropha
H16的底盘细胞设计，以实现木质素向PHB的高效转化提供了重要依据。
然而，研究发现
R. eutropha
H16并不能以香草酸和异香草酸作为唯一碳源进行生长。与原儿茶酸的结构相比，香草酸和异香草酸的侧链中具有甲氧基结构，可能是阻碍其代谢的主要因素。此外，香兰素、4-羟基苯甲醛和 3,4-二羟基苯甲醛等芳香醛类物质也是木质素解聚的主要产物。经检测，芳香醛类的代谢除4-羟基苯甲醛能够在24小时延滞期后可被
R.
eutropha
H16缓慢代谢之外，其余均难以代谢。因此，为了使
R. eutropha
H16 能够有效地转化LDAs，增强其对芳香醛物质的耐受性和代谢能力至关重要。
因此，本研究采用异源表达去甲基酶及辅助酶来赋予其代谢能力，在菌株中表达
Sphingomonas
sp. SYK-6 的O-去甲基化酶相关基因
ligM
，同时表达四氢叶酸再生系统
ligH
及
metF
基因，向 LigM 提供四氢叶酸进行去甲基化催化。然而，该体系对香草酸的利用效率仍比较低。
将来自
P. putida
KT2440 的
vanAB
在
R. eutropha
H16中异源表达，并赋予其甲醛解毒模块。结果表明，甲醛解毒模块和VanAB 去甲基化模块的整合成功地赋予了
R. eutropha
H16对芳香族化合物进行 O-去甲基化的能力，在香草酸的代谢过程中表现出更有效的性能
。
识别和表征芳香族反应调节元件
为了构建一个可以调节LDAs代谢所需基因的稳健表达的自动调节系统，本研究首先在
R. eutropha
H16 中鉴定和表征了能够响应LDAs的潜在基因调控元件。根据细菌底物代谢分析和功能基因注释，有6个主要基因簇，包含负责苯甲酸盐、苯酚、水杨酸、龙胆酸、4-羟基苯甲酸和原儿茶酸代谢的典型基因调控元件。
本研究中鉴定了能够响应LDAs的基因调控元件，并分析了6个主要基因簇，这些基因簇负责不同芳香族化合物的代谢。以原儿茶酸代谢的基因簇为例，调节蛋白PcaQ控制相关基因的表达。此外，本研究还系统性地评估了这些内源性调控元件的动态范围、剂量反应、正交性和反应敏感性。通过RT-qPCR分析了它们在底物诱导剂存在下的敏感性和持久性。结果显示，除了PoxR外，其他调节系统对底物高度敏感并迅速开启基因表达。调节系统的持久性在不同系统间有差异，PcaQ和GenR显示出最短的调节持久性，而NagR的调节作用最持久。调节元件的敏感性和持久性与诱导剂的运输和消耗密切相关，
R. eutropha
H16
能迅速代谢某些底物，导致相应调节系统的波动更加剧烈。PcaQ和GenR表现出快速开关能力，而PoxR则表现出明显的延迟，NagR则能灵敏、快速地响应诱导剂并长期维持调节。
构建基于芳香族枢纽代谢物的自动调节系统
为了精确调节代谢 LDAs异源功能基因的表达，调节系统需要智能地对每种底物做出反应。为了应对这一挑战，本研究设计了基于微生物生物漏斗代谢特性和调控蛋白 PcaQ的
HMA
系统来调控各种可以响应的LDAs向原儿茶酸的转化。
HMA
系统集成了将 LDAs 转化为枢纽代谢物原儿茶酸所需的功能基因，在设计的基于LDAs代谢物的自动调节系统中，PcaQ启动子引导的功能基因的低水平泄漏表达将使宿主能够将目标底物略微转化为原儿茶酸，而产生的原儿茶酸会反馈给调控蛋白PcaQ，以增强受 PcaQ启动子调控的功能基因的表达强度，进一步促进靶底物转化为枢纽代谢物原儿茶酸，同时实现对不同类型LDAs的自我增强调节。
蛋白质工程改造调控蛋白PcaQ
基于枢纽代谢物的
HMA
系统需要对不同芳香族化合物的反馈调节强度与细胞内原儿茶酸的浓度密切相关，但是芳香族化合物在微生物中的矿化过程是连续的，枢纽代谢物原儿茶酸将被有效代谢并维持在低浓度水平，这将对调节蛋白 PcaQ 的有效响应构成挑战。为此，通过蛋白质工程（包括关键位点预测和分子动力学计算）合理设计了调控蛋白PcaQ的突变体。使用HotSpot Wizard 2.0 预测了活性口袋周围和底物通道中影响底物与蛋白质结合的关键位点，发现可修饰关键氨基酸位点得分排名前三的关键位点是 PcaQ-Met143、Arg145 和 Asn146。通过计算 57 个蛋白质突变体 （具有 3 个氨基酸的饱和突变） 和配体小分子的结合能，选择结合能最低的组合最终得到对诱导剂更加敏感的突变体 PcaQR145K。与 PcaQ 相比，突变体 PcaQR145K在低底物浓度下，报告基因的转录水平增加。而分子对接结果表明，原儿茶酸与PcaQ和 PcaQR145K的结合能分别是-5.1
Kcal/mol 和-5.9 Kcal/mol。研究最终选择了PcaQR145K作为调控蛋白，突变体 PcaQR145K更好地补偿了这一缺陷，并在低原儿茶酸浓度下提供更强的反馈调节。
