E&H专栏｜清华大学周小红课题组：用于遗传毒性评价的酵母细胞DNA损伤蛋白生物标志物

在内源性和外源性DNA损伤源的不断攻击下，为了确保基因组的稳定性，细胞发展出了复杂的DNA损伤应答机制，其中包括许多相互依存的信号通路和机制。虽然Ames试验、彗星试验、微核试验和SOS/umu试验一直是检测遗传毒性的重要工具，但它们的局限性也不容忽视，如耗时长、只能提供表型结果或依赖于DNA损伤反应途径中单一生物标志物的变化，无法全面覆盖DNA损伤修复通路。

本研究报道了一组可用于遗传毒性评价的酵母细胞蛋白标志物。我们通过公共基因组学数据库识别了酵母细胞中171个与DNA损伤应答机制密切相关的蛋白标志物，基于STRING数据库构建蛋白互作网络，筛选出在网络中位于重要位置的蛋白标志物70个选取，进一步以GFP融合酿酒酵母（ S. cerevisiae ）菌株为模式生物，获取覆盖不同毒性作用机制的阳性化合物暴露下蛋白表达谱，识别出响应最灵敏的蛋白标志物15个。通过不同的计算模型引入标志物之间的权重，建立定量单一的分子毒性检测终点，对阴性阳性化合物可准确缺区分。该组蛋白标志物可应用于环境样品的遗传毒性机制评价。

1、公共数据库识别相关蛋白

在本研究中，基于文献报道以及公共数据库NCBI和KEGG的数据，我们共识别出与DNA损伤响应和修复密切相关的171个基因。这些基因在酿酒酵母的DNA损伤反应网络中起着至关重要的作用。根据功能分析，这些基因参与了多个DNA损伤应答通路，包括：DNA损伤信号转导通路（DDS）、直接激活的跨损伤合成（TLS）通路，以及多种DNA修复通路，如同源重组修复（HR）、非同源末端连接（NHEJ）等。

为进一步理解这些基因在DNA损伤修复中的具体功能，我们使用了STRING数据库中的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析工具，构建了这些与DNA损伤反应相关蛋白质的相互作用网络。通过对网络中的节点分析，我们发现有70个蛋白质在所有八种DNA损伤响应途径中表现出了较高的相互作用度（degree）。这些蛋白质可以作为DNA损伤反应的重要生物标志物，用于后续的高通量筛选和验证。

在这些筛选的70个蛋白中，有42个蛋白质（60%）表现出显著的表达变化，并被进一步鉴定为八种DNA损伤响应通路的关键成员。根据这些数据，我们绘制了化合物-基因-DNA损伤响应通路的桑基图，其中显示了不同基因与化学物质之间的关系和基因在不同通路中的作用。通过对这些标志物的进一步分析，我们成功筛选出15个在三种遗传毒性物质中表现出最强响应的蛋白标志物。

图1. 酵母细胞中的DNA损伤应答途径。数据来源于已报道研究以及公共数据库NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和KEGG (https://www.kegg.jp/)。亮蓝色圆圈：表示蛋白作为蛋白质复合物起作用。黄色：DNA损伤检查点的机制。粉色：跨损伤合成 (TLS) 机制。蓝色：从上到下的六种DNA损伤修复途径：直接修复 (DRR)、碱基切除修复 (BER)、核苷酸切除修复 (NER)、错配修复 (MMR)和双链断裂修复 (DSB)。

图2. 酵母细胞中DNA损伤蛋白生物标志物的选择。(A) 基于STRING数据库（https://string-db.org/）的蛋白质相互作用网络。图2中的基因编码了171种蛋白质。气泡的颜色代表某种蛋白质在网络中的程度。(B) Sankey图展示了通路-基因关系和基因-遗传毒性物质反应。该图说明了各种DNA损伤反应途径、基因和化学物质之间的复杂关系。该图由三列组成：途径（左：DRR、DDS、HR、NHEJ、BER、TLS、MMR和NER）、基因（中间）和遗传毒性物质（右：MMS、MMC和4-NQO）。化学物质与基因之间的链接宽度代表了特定基因对遗传毒性物质的反应水平。对遗传毒性物质反应水平较高的蛋白集中在桑基图上侧。(C) 两种培养基荧光信号的比较。

2、定量分子终点的定义

对阴性对照组和遗传毒性物质进行了持续2小时的蛋白质表达谱分析，发现了15种与DNA损伤应答途径相关的蛋白质。遗传毒性制剂会诱导DNA损伤，从而激活DNA损伤应答途径，并导致大多数蛋白质上调。相反，阴性对照组的蛋白质表达下调或变化不大。与先前报道的PELI方法得出的结果相比，考虑了这些生物标志物权重的四个模型得出的PELI值是一致的。所有五个PELI分子终点都能有效区分遗传毒性物质和阴性对照，其中遗传毒性物质的PELI值大于1.5，而阴性对照的PELI值不大于1.5。

图3. 在2小时内暴露于阴性对照（A、B、C、D）或遗传毒物（E、F、G、H、I）下的15种蛋白生物标志物的蛋白质表达谱分析。lnI（诱导因子的自然对数值）用于表征蛋白质上调或下调的幅度（用绿-黑-红颜色标度表示：红色光谱颜色表示上调，绿色光谱颜色表示下调）。大于±1.5的值用与±1.5相同的颜色表示。X轴上方：待测物浓度。X轴下方：以分钟为单位的暴露时间。Y轴右侧：本研究中测试的15种生物标志物、内部参考基因PGK1和野生型对照的列表。 n =3

3、基于遗传毒性机制的化学品分类

层次聚类有效地分离了阴性对照物和遗传毒性物质，根据DNA损伤反应途径的激活情况将它们分为三类。四种阴性物质，即双酚A、红霉素、盐酸四环素和阿司匹林，形成了一个以各种DNA损伤修复途径无明显激活为特征的类别。在遗传毒性物质中，MMC和MNNG构成一类，在一定程度上激活了DNA损伤应答途径。其他三种遗传毒性物质，即CDDP、MMS和4-NQO对所有DNA损伤修复途径的激活作用更为明显，这在热图中的红色区域很明显。

图5. 基于DNA损伤修复途径活化程度的分层聚类分析图，以及五种经测试的遗传毒性阳性模型和四种阴性对照的lnI值。DNA损伤修复途径的激活程度用PELIsd的算术平均值表示（用0至1.5的黑红色刻度表示，大于1.5的值用与1.5相同的颜色表示）。X轴底部：DNA损伤修复途径。Y轴右侧：样本名称。

本研究基于GFP融合酵母，筛选了15种蛋白生物标志物，通过分钟级分辨率的多通路激活数据，可用于遗传毒性化合物的筛查与评价。我们的研究展示了一种快速、高效遗传毒性机制筛查的独特方法，未来通过引入更多应激反应（如氧化应激和膜应激）相关的蛋白生物标志物，有望更全面地开展环境样品的毒性筛查与评价。