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糖酵解与组蛋白乳酸化的正反馈调节驱动胰导管腺癌的发生

BCML速递 · 公众号 · · 2024-08-29 22:00

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胰腺癌是一种高侵袭性的消化系统肿瘤，也是最为致命的恶性肿瘤，其中胰导管腺癌（ PDAC ）占 80% 以上。在过去十年中治疗方式的改进并未使 PDAC 死亡率出现显著下降。因此，有必要更清楚地了解 PDAC 的生长和转移机制，从而寻找潜在的治疗靶点和新的生物标志物预测 PDAC 预后。大量的研究表明，包括 PDAC 在内的许多肿瘤利用代谢重编程来支持细胞的恶性行为，如快速增殖、侵袭等过程。代谢物是细胞能量代谢的中间产物，由各种酶通过相应的翻译后修饰催化。越来越多的代谢物被报道参与肿瘤发生发展中的不同信号通路的调节。其中，乳酸是一种丰富的肿瘤细胞代谢物，是糖酵解的终产物，并为 Warburg 效应（有氧糖酵解）期间的三羧酸循环提供底物。糖酵解增强和乳酸积累是各种类型肿瘤的共同特征。然而，代谢重编程如何重塑表观遗传改变，特别是 PDAC 中的乳酸化，目前仍不清楚。因此，来自北京大学的 Tianpei Hong 教授和 Rui Wei 教授团队合作，揭示了糖酵解产物乳酸所介导的组蛋白乳酸化对 PDAC 发生发展的影响，为理解和靶向 PDAC 的复杂生物学机制提供了新的见解和视角。

1. 升高的组蛋白乳酸化水平与 PDAC 患者的不良预后相关

首先，研究者发现 PDAC 患者胰腺组织的乳酸含量高于正常的邻近组织（图 1A ），同时，几种 PDAC 细胞系的乳酸产量也高于正常细胞（ hTERT-HPNE ）（图 1B ）。 PDAC 患者和健康对照血清样本的代谢组学结果显示两组间共有 222 种代谢物的显著不同（图 1C ），乳酸也是其中之一，并富集到“癌症的中心碳代谢”途径当中（图 1D ）。随后，研究者进一步发现与周围非癌组织相比， PDAC 组织的整体 / 泛赖氨酸乳酸化（ Pan Kla ）水平以及 H3K18 乳酸化（ H3K18la ）水平升高（图 1E ）。此外，与正常胰腺导管上皮细胞系相比， Pan Kla 以及 H3K18la 的表达在四种 PDAC 细胞系中显著上调（图 1F ）。接下来，研究者通过 IHC 染色评估了 74 例 PDAC 组织和 72 例癌旁组织。如图 1G 和 H 所示，与正常组织相比， PDAC 中 H3K18la 的水平显著上调。在 PDAC 患者中， 51.4% 的样本显示高 H3K18la 水平，这比正常组更普遍（图 1I ），且升高的 H3K18la 水平与 AJCC 阶段呈现正相关（图 1J ）。基于 H3K18la 水平的 Kaplan-Meier 生存图，研究者进一步通过 Log-rank 检验确定 H3K18la 可能与预后相关（图 1K ）。

2. 抑制糖酵解减少组蛋白乳酸化，并抑制 PDAC 细胞增殖和迁移

接着，为了阐明糖酵解对组蛋白乳酸化的影响，研究者使用了不同种类的糖酵解抑制剂（ DCA 、 Oxamate 和 2-DG ），并在 MIA PaCa-2 和 AsPC-1 细胞中进行了 LDHA 敲降。随着抑制剂剂量的增加， Pan Kla 和 H3K18la 的水平持续降低（图 2A-B ）。此外， si- LDHA 有效地降低了细胞内 LDHA 蛋白和组蛋白乳酸化的水平，并在外源性乳酸钠补充后部分恢复（图 2C-D ）。随后，研究者探究了组蛋白乳酸化对细胞增殖和集落形成等生物学功能的影响，观察到糖酵解抑制剂处理（图 3A-F ）或 LDHA 沉默（图 3G-L ）后细胞活力和集落形成能力显著降低，而补充乳酸钠后抑制作用减弱（图 3G-L ）。研究者进一步通过划痕试验和 Transwell 试验探究乳酸化是否影响 PDAC 细胞的迁移，结果显示糖酵解抑制剂处理或 LDHA 沉默显著降低了 MIA PaCa-2 和 AsPC-1 细胞的迁移，而乳酸钠的补充减弱了抑制作用（图 4A-P ）。综上所述，这些发现表明组蛋白乳酸化在 PDAC 的起始和进展中可能起着至关重要的作用，而抑制组蛋白乳酸化可能表现出潜在的抗 PADC 活性。

3. 抑制糖酵解在 PDAC 异种移植小鼠模型体内减少组蛋白乳酸化并干预 PDAC 进展

研究者通过将 MIA PaCa-2 细胞植入裸鼠皮下建立异种移植小鼠模型，用糖酵解抑制剂草酸盐处理小鼠，每两天检测一次肿瘤体积。在整个实验过程中，糖酵解抑制剂组的肿瘤体积和重量显著低于对照组（图 5A-C ）。同时，为了进一步研究 LDHA 敲除对肿瘤生长的影响，将稳定的 sh- LDHA 和 MIA PaCa-2 细胞注射到裸鼠皮下。与糖酵解抑制剂的结果相似，与对照组相比， LDHA 敲除组显示出更小的尺寸和更低的重量（图 5I-K ）。接下来，研究者检测了糖酵解抑制对异种移植小鼠模型中乳酸产量和蛋白乳酸化修饰的影响。正如预期的那样，糖酵解抑制剂处理或 LDHA 敲除后肿瘤组织中乳酸的含量减少（图 5D 和 L ），并观察到肿瘤组织中 Pan Kla 和 H3K18la 的水平降低（图 5E-F ， M-N ）。此外，增殖标志物 Ki-67 染色和肝脏 HE 染色表明，糖酵解抑制剂和 sh LDHA 处理均降低了肝脏中 Ki-67 的表达并减少了肝脏中的转移灶（图 5G-H ， O-P ）。这些结果表明，糖酵解抑制剂处理或 LDHA 敲低显著降低了 PDAC 肿瘤组织的增殖和进展。

4. P300 是 PDAC 细胞中组蛋白乳酸化的潜在 writer

据报道，乙酰转移酶 P300 是组蛋白乳酸化的潜在 writer ，然而 P300 在 PDAC 进展中的作用鲜有研究。因此，为了评估 P300 对乳酸化的影响，研究者使用 si- P300 或 C646 （一种 P300 抑制剂）处理 MIA PaCa-2 和 AsPC-1 细胞，并补充或补充不外源性的乳酸钠。结果显示，即使在补充乳酸钠的条件下 si- P300 或 C646 处理后 MIA PaCa-2 细胞中的 Pan Kla 和 H3K18la 水平仍显著降低（图 6A ）。在 AsPC-1 细胞中也观察到类似的结果（图 6B ）。这些结果表明 P300 可能是组蛋白乳酸化的潜在 writer 。与此同时， P300 沉默或 C646 诱导的乳酸化修饰水平降低，使得即使在外源性补充乳酸钠的条件下，两种细胞的增殖同样显著减少（图 6C-F ）。进一步的划痕试验和 transwell 试验结果表明，沉默 P300 或用 C646 处理显著抑制了 MIA PaCa-2 （图 6G-H ）和 AsPC-1 细胞（图 6I-J ）的迁移能力，并且这种抑制效果即使在外源性补充乳酸钠的条件下依然存在。这些结果表明，组蛋 P300 作为组蛋白乳酸化的潜在 writer ，能够促进 PDAC 的进展。

5. H3K18la 激活 PDAC 中 TTK 和 BUB1B 转录

为了进一步揭示 H3K18la 如何影响 PDAC 的进展，研究者进一步使用特异性 H3K18la 抗体进行了 CUT&Tag 检测。在糖酵解抑制剂处理组，转录起始区域（ TSS ）的修饰富集明显减少（图 7A-B ），在启动区域观察到约 53% 的富集（图 7C ）。特异性启动子区域下调峰的 KEGG 分析揭示了其在 RNA 转运途径、细胞周期和肿瘤相关途径（如 MAPK ）的相关信号通路富集（图 7D ）。此外，研究者同时利用 RNA-seq 分析来筛选受乳酸化调节的潜在靶基因。结果显示与对照组相比，糖酵解抑制剂处理上调了 PDAC 细胞中的 1259 个基因，下调了 303 个基因（图 7E ），这些下调基因的 KEGG 分析也显示在细胞周期途径的富集（图 7F ）。

研究者进一步结合 GEPIA 数据库和两个高通量测序的结果，最终筛选出 TTK （也称为 MPS1 ）和 BUB1B （也称为 BUBR1 ）这两个基因。在用糖酵解抑制剂处理的细胞中，鉴定出 TTK 和 BUB1B 的启动子处的修饰丰度明显减少（图 7H ），进一步利用 ChIP-qPCR 证实 H3K18la 在 TTK 和 BUB1B 启动子处的富集，并且这种富集能够被糖酵解抑制剂抑制（图 7I ）。此外， TTK 和 BUB1B 的 mRNA 和蛋白的水平也在糖酵解抑制剂处理后显著下调（图 7J-K ）。这些结果表明， TTK 和 BUB1B 的激活可能参与了 H3K18la 介导的 PDAC 进展。

6. 高水平的 TTK 和 BUB1B 与 PDAC 的恶性程度相关

为了研究 TTK 和 BUB1B 在 PDAC 进展中的作用，研究者首先检测了它们在 PDAC 进展中的表达。 PDAC 细胞系中， TTK 和 BUB1B 的转录和蛋白水平显著高于正常的 hTERT-HPNE 细胞（图 8A-B ）。免疫组织化学染色结果显示，与癌旁正常组织相比， PDAC 组织中 TTK 和 BUB1B 表达显著增加（图 8C ）。此外，通过 GEPIA 和 Kaplan-Meier Plotter 数据库分析表明，高表达 TTK 或 BUB1B 的 PDAC 患者的总体生存率或无病生存时间较低表达的患者短（图 8D-G ）。

7. TTK 和 BUB1B 缺失抑制 PDAC 恶性肿瘤，而 TTK 过表达部分恢复乳酸化抑制的抗癌效应

为了评估 TTK 和 BUB1B 在 PDAC 中的功能，研究者使用 siRNA 转染来敲低 MIA PaCa-2 和 AsPC-1 细胞中的 TTK 和 BUB1B 的表达（图 9A-B ）。与对照组相比， TTK 或 BUB1B 敲除导致细胞活力显著降低（图 9C-D ），并抑制细胞迁移（图 9E-H ）。接着，为了研究 TTK 在 H3K18la 介导的 PDAC 进展中的作用，研究者用糖酵解抑制剂处理 TTK 过表达的 MIA PaCa-2 细胞（图 9I ）。与上述结果相似，糖酵解抑制剂抑制 MIA PaCa-2 细胞的生长和迁移。值得注意的是， TTK 过表达与糖酵解抑制剂损害了糖酵解抑制剂对细胞生长抑制和迁移抑制的作用（图 9J-L ）。这些结果表明 TTK 和 BUB1B 参与 H3K18la 介导的 PDAC 进展。

8. H3K18la 靶基因与糖酵解之间的正反馈回路

先前的研究报道了 BUB1B 的表达与肺腺癌细胞周期和糖酵解呈正相关。 BUB1B 敲除可减少糖酵解相关基因，表明 BUB1B 在糖酵解代谢中作为激活剂促进肺腺癌。因此，研究者假设 BUB1B 可能作为糖酵解的关键调节因子，从而促进 PDAC 细胞的异常增殖。有趣的是，在用 si- TTK 、 si- BUB1B 或两者组合转染的 PDAC 细胞中， P300 的水平显著降低（图 10A-B ）。考虑到 P300 在上述结果中被证明是组蛋白乳酸化的 writer ，研究者猜测在 PDAC 进展过程中，不仅糖酵解组蛋白乳酸化 -TTK/BUB1B 通路是存在的，并且 TTK/BUB1B 在组蛋白乳酸化中可能起到正反馈作用，从而进一步加剧恶性程度。 LDHA 在乳酸的合成中起着关键作用，它驱动癌细胞发生代谢重编程从而转向有氧糖酵解的代谢模式。考虑到 TTK 对酪氨酸和丝氨酸 / 苏氨酸残基的双特异性激酶活性，研究者进一步探究了 TTK 是否具有磷酸化 LDHA 的能力。研究者利用 Co-IP 研究了 TTK 和 LDHA 之间是在体内否存相互作用：用 LDHA 抗体进行 IP ，然后用 TTK 抗体进行蛋白质印迹，证实了相互作用在 MIA PaCa-2 和 AsPC-1 细胞中 TTK 和 LDHA 之间的相互作用（图 10C-D ）。此外， TTK 的敲低显著抑制了 Y239 处磷酸化 LDHA 的表达，而 Y10 处的磷酸化降低没有统计学差异（图 10E-F ）。研究者还检测了 LDH 的活性，发现抑制 TTK 可以抑制 LDH 的活性（图 10G-H ），这些结果表明 TTK 与 LDHA 之间的相互作用，并能够影响其磷酸化和活性。接下来，研究者评估了 LDHA 磷酸化的下游，以研究 TTK 对 PDAC 细胞糖酵解的影响。结果显示 TTK 敲低减少了乳酸的产生（图 10I-J ），并降低了 Pan kla 和 H3K18la 的水平（图 10K-L ）。这些结果表明 TTK 在糖酵解和组蛋白乳酸化之间的正反馈中起作用。

综上所述，该研究证实乳酸至少部分通过介导组蛋白乳酸化，尤其是 H3K18la ，促进癌细胞的增殖和迁移。该过程由 TTK 和 BUB1B 参与介导，并进一步增强糖酵解增加乳酸化。该研究为代谢重编程和表观遗传调控提供了新的探索和补充，并为 PDAC 的治疗提供了潜在的新策略。

本研究由北京大学的 Tianpei Hong 教授和 Rui Wei 教授团队合作完成，并于 2024 年 5 月 6 日在线发表于 Molecular Cancer 。

论文信息： Fei Li, Wenzhe Si, Li Xia, Deshan Yin, Tianjiao Wei, Ming Tao, Xiaona Cui, Jin Yang, Tianpei Hong*, Rui Wei*. Positive feedback regulation between glycolysis and histone lactylation drives oncogenesis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Molecualr Cancer 2024, 23: 90.

供稿：朱壮

审校：孙亨

编辑：许梦平