Plus深读 | TNF受体小分子多肽抑制TNF-p38信号轴及炎症反应

背景介绍

肿瘤坏死因子（TNF）α是一种在多种生物效应中起作用的细胞因子，主要由单核细胞、巨噬细胞和胸腺依赖淋巴细胞（T淋巴细胞）产生，通过与其受体（TNF receptor，TNFR）1和2特异性结合引起一系列细胞因子改变，发挥功能。TNFα参与细胞的凋亡和存活、炎症反应、免疫反应等重要的生理过程，在类风湿性关节炎、克罗恩病和银屑病等疾病的发生发展中扮演了重要角色。

近年来，以TNFα作为关键药物靶点，研制出了英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗等单克隆抗TNFα抗体及TACE抑制剂等小分子抑制剂，在临床治疗中取得了显著的疗效。但拮抗TNFα是一把双刃剑，在表现出治疗作用的同时， TNFα大分子抑制剂的感染、免疫原性和肿瘤等不良反应时有报道，小分子抑制剂则常存在作用不专一的问题。因此，研究者希望可以获得作用更加精准特异、不良反应更少的TNFα抑制剂，并且不影响TNFα在宿主防御中可能起到的有利生物学功能。

文章概括

在这篇文章中，研究者发现TNF _70-80 （具有TNF 70-80位氨基酸序列的小分子多肽）能与TNF受体结合，通过TNF受体相关因子2（TRAF2）激活p38 MAPK活性，并引起中性粒细胞呼吸爆发。在此基础上，研究者合成了含有TNFRI部分序列的多肽，发现特定序列的TNFRI多肽能与TNF _70-80 结合，并抑制TNF _70-80 激活p38信号通路及中性粒细胞呼吸爆发。此外，通过体内实验研究者进一步发现TNFRI多肽可以抑制小鼠慢性及急性炎症模型中的炎症反应。研究者的发现为通过TNFR小分子生物制剂靶向TNF-p38信号通路治疗慢性炎症疾病提供了新的线索与依据。

研究结果

1. TNF _70-80 通过TNFRI激活p38

研究者首先检测了TNF _70-80 影响中性粒细胞呼吸爆发的分子机制。通过体外酶活实验和化学发光测定，研究者发现与TNF全长蛋白类似， TNF _70-80 激活了p38 MAPK，并且促进了中性粒细胞的呼吸爆发， 导致超氧化物增加（Fig 1a, 1b）；并且p38的抑制剂SB203580可以抑制这种由TNF _70-80 导致的呼吸爆发（Fig 1c）。

为了探究TNF _70-80 如何激活p38，研究者进一步检测了TNF _70-80 是否能与细胞表面的TNF受体（TNFR）相结合。研究者选取了缺少TNFR无法响应TNF的70Z/3细胞株，检测发现只有在细胞中转染表达TNFRI后，TNF或TNF _70-80 才能激活p38（Fig 1d）。另一实验发现生物素标记的TNF _70-80 与TNFRI的结合可以被未标记的TNF _70-80 竞争性取代（Fig 1e）。基于以上结果，研究者认为 TNF _70-80 与TNFR结合并激活p38 。进一步的研究表明这种激活需要通过TNF受体相关因子2（TRAF2）（Fig 1f）。

Fig 1：TNF _70-80 通过TNFRI激活p38

2. TNFRI多肽可以抑制由TNF引起的中性粒细胞呼吸爆发效应

1）确定具有抗TNF效应的TNFRI多肽序列

如果能确定TNFRI与TNF _70-80 结合的结构域，是否就可以靶向RNF-p38信号通路，为治疗提供新的思路呢？为此研究者首先构建了带有His标签的TNFRI截短不同胞外部分的片段（Fig 2a），标记为M1（截去第一个半胱氨酸富集域(CRD)）和M4（截去所有4个CRD），在70Z/3细胞中转染野生型及截短的TNFRI，发现TNF _70-80 对p38的激活水平在统计学上没有显著性差异（Fig 2b）。

由于M4片段还保留了TNFRI位于胞外部分的三个碱基GTT(标记为TNFRI _209-211 )，研究者认为 这可能是TNFRI与TNF _70-80 结合并激活p38的最小区域 （Fig 2c）。化学发光测定发现TNFRI的ΔHM4（含有LKPGTT序列，LKP为连接氨基酸）片段对由TNF _70-80 引起的中性粒细胞呼吸爆发效应具有剂量依赖的抑制作用（Fig 2d, 2e）。

Fig 2：TNFRI多肽具有抗TNF效应

2）TNFRI多肽可以抑制TNF引起的中性粒细胞呼吸爆发效应

为了排除ΔHM4中连接氨基酸LKP的作用，研究者合成了三个不同的TNFRI片段，TNFRI _209-211 （GTT）、TNFRI _206-211 （EDSGTT）和TNFRI _198-211 （QIENVKGTEDSGTT）。在化学发光检测中，与对照多肽相比，多肽TNFRI209-211对由TNF引起的中性粒细胞呼吸爆发效应具有剂量依赖的抑制作用（Fig 3a, 3c）。同样的实验中多肽TNFRI _206-211 和TNFRI _198-211 也具有类似的抑制效应（Fig 3b, 3d, 3e）。虽然TNFRI多肽可以抑制TNF的效应，但不能抑制由趋化三肽fMLF引起的中性粒细胞呼吸爆发（Fig 3f, 3g），提示这种抑制具有特异性。此外，在富含TNF的培养基中，TNFRI _209-211 、TNFRI _206-211 也能抑制中性粒细胞的生物学效应（Fig 3h, 3i）， 进一步验证了TNFRI多肽对由TNF引起的中性粒细胞呼吸爆发效应的抑制作用。

Fig 3：TNFRI多肽可以抑制由TNF引起的中性粒细胞呼吸爆发效应

3）TNFRI多肽与TNF及TNF _70-80 结合并影响呼吸爆发

研究者首先验证了多肽TNFRI _206-211 和TNFRI _198-211 能与TNF或TNF _70-80 结合（Fig 4a, 4b）。与此同时，研究者检测了来源于TNFRI半胱氨酸富集域CDR1/2/3的多肽，发现这些多肽并不影响TNF引起的中性粒细胞呼吸爆发效应（Fig 4c），从而进一步证明了TNFRI _206-211 等多肽具有特异性的抗TNF效应。

Fig 4：TNFRI多肽与TNF及TNF _70-80 结合并影响呼吸爆发

3. TNFRI多肽可以抑制炎症反应

除了对TNF引起的中性粒细胞产生的氧自由基有抑制作用，研究者还发现TNFRI多肽可以抑制由TNF引起的IL-1β和IL-8生成、以及CD11b/CD18表达上调（Fig 5a-d）。这些结果提示了这些TNFRI多肽具有抗炎症的效应。

Fig 5：TNFRI多肽抑制由TNF引起的CD11b及细胞因子表达

那么TNFRI多肽在体内是否也有相似的抗炎症效应呢？研究者以TNFRI _206-211 作为研究对象，发现TNFRI _206-211 可以抑制LPS引起的淋巴细胞及中性粒细胞的浸润（Fig 6a, 6b），对于角叉菜胶或抗原诱导的小鼠慢性及急性炎症模型也有抑制作用（Fig 6d）。

为了进一步确认多肽TNFRI _206-211 在体内的抗炎效应，研究者构建了RSV诱导的小鼠肺炎模型，并发现与对照组小鼠比较，经TNFRI _206-211 处理的小鼠细支气管的淋巴细胞浸润及肺部的炎性分泌物显著减少（Fig 6e, 6f），并且细支气管肺泡灌洗液中的淋巴细胞数目和IFN-γ含量也显著减少（Fig 6g, 6h）。值得注意的是， TNFRI _206-211 处理不仅具有显著的抗炎症效应，还能减少肺部的病毒载量 （Fig 6j）。

Fig 6：TNFRI206-211可以抑制炎症反应

4. TNFRI206-211选择性抑制TNF-p38信号轴

以上实验中观察到的TNFRI206-211抗炎效应是否是特应性阻断了TNF-p38信号通路呢？研究者发现与对照相比，多肽TNFRI206-211能抑制中性粒细胞、前巨噬细胞中由TNF引起的p38激活（Fig 7a-c），而不能抑制中性粒细胞中fMLF引起的p38激活（Fig 7d），也不能抑制TNF通路中ERK1/ERK2、JNK及NF-κB的激活（Fig 7f-7h），提示TNFRI206-211的抗炎症效应是通过特异性抑制TNF-p38信号轴来实现的。同时研究发现TNFRI多肽不影响TNF与TNFR的结合（Fig 7i）。

Fig 7：TNFRI206-211选择性抑制TNF-p38信号轴

在这篇文章中，研究者发现TNF70-80能与TNF受体结合激活p38 MAPK活性，并引起中性粒细胞的呼吸爆发。在此基础上研究者找到了能有效抑制由TNF引起的炎症反应的TNFRI的多肽序列，并通过体内体外实验验证了TNFRI多肽可以特异性抑制TNF-p38信号通路从而减轻炎症效应，为新的抗炎药物筛选提供了新的靶标和理论基础。

与目前已经有的抗TNF治疗相比，TNFRI多肽作为潜在的新抗炎药物的优势在于：

1）TNFRI多肽特异性抑制TNF-p38信号通路：

i）TNFRI多肽仅仅靶向由TNF引起的p38激活，保留了其他因子激活p38信号通路产生的正常生物学功能。

ii）TNFRI多肽不影响TNF与TNFR结合，也不影响由TNF引起的其他通路如ERK1/ERK2、JNK和NF-κB的激活。

2）TNFRI多肽不仅对非感染性炎症有效，对感染性炎症也有抑制作用。