Western-Blot之我的磷酸化蛋白之路

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作者：阿甘（转载请注：解螺旋·医生科研助手）

我们实验室有句话口口相传：做上WB，走上不归路。WB难，磷酸化蛋白的WB就更难了。

我一共做了两百多次磷酸化的蛋白，但是出结果的只有六十几次，与理论预期相一致的只有四十多次，之前的几十次更是连磷酸化蛋白的影子都没见到。做了这么多失败的磷酸化蛋白WB，宝宝的心里苦呀！但宝宝不哭！

于是乎，我总结了一下我的操作经验，供大家在做磷酸化蛋白的时候参考，使大家的磷酸化蛋白之路顺利（其中最重要的东西已用蓝色标出）。

1.做磷酸化蛋白，磷酸酶抑制剂必不可少，若没有磷酸酶抑制剂，磷酸化蛋白很容易发生去磷酸化，轻者导致条带不明显，重者没有条带，从而导致实验重复性变差。下图就是加入磷酸酶抑制剂和不加磷酸酶抑制剂的区别（有图有真相，图1）。

图1. 加入磷酸酶抑制剂和不加入磷酸酶抑制剂的条带区别

2. 提蛋白一定全程要在4℃环境，尽量不要用超声波细胞破碎仪来粉碎细胞，低温高速离心机的转速不要超过14000rmp，时间不要超过10分钟，以5到8分钟为宜。得到的上清样品立即煮沸（最好用PCR仪煮沸）。所提取的蛋白样品一定要在两到三个星期之内全部做完。

3.凝胶电泳时，配置凝胶的试剂必须是两周之内新配制的，电泳缓冲液和转膜缓冲液必须现配现用，电泳时间不能超过2个小时。转膜完成后要用TBST缓冲液漂洗PVDF膜。

4.封闭液和抗体稀释液，最好选用3%或者5%的BSA溶液（具体浓度看抗体说明书）。不可以用牛奶去配制上述液体，因为牛奶里还有酪蛋白，可以促进蛋白质的去磷酸化，使磷酸化蛋白的条带变浅，甚至消失（用图说话，图2）。抗体尽量选用品牌抗体（Abcam，CST），一分钱一分货。

图2. BSA和脱脂奶粉封闭后的条带差别

想想当初，我的第一个磷酸化蛋白p-AKT做了好几十次都没出来，工作汇报时，分分钟被老板嫌弃的节奏，以至于我有点怀疑人生。后来随着操作细节的改进，我的磷酸化蛋白的WB成功率越来越高，老板对我的WB结果也越来越满意。苍天不负有心人，只要肯下功夫，多观察多思考，小白也会成为达人。最后，祝大家实验顺利，早日成为实验达人！