关于下一代测序（NGS）在诊断孟德尔单基因遗传性疾病中的最佳应用方面的讨论颇多。基因Panel非常受欢迎，由于其测序成本低，周转时间短，非特异性或偶然发现率低，只有约10％的整个外显子组测序（WES）可检测到的突变被错过。事实上，与患者表型有关的基因Panel检测可以被视为一种廉价和快速的一线测试。如果这个测试是阴性的，WES或全基因组测序（WGS）可以被认为是最全面的二线测试（
游侠认为当WES与Panel价格接近时，还是WES优先
）。
在WGS中，全基因组的reads分布可以允许可靠地检测拷贝数变异（CNV），CNV在遗传疾病变异中有重要占比。WGS价格下跌，包括数据分析在内的周转时间可以缩短到几天，虚拟Panel可以在分析时选择，以避免偶然发现，
诊断率可高达73％（这个游侠也比较吃惊，自己看原文参考文献啊）
，比传统的表型指导的单基因检测要高一个数量级。因此，WGS可以视为WES的替代方案。
最近我们发现，即使是目前的WES平台在充分捕获整个外显子组方面也存在问题，而WGS无需捕获对GC含量较不敏感，并且比WES更有可能提供完整覆盖整个基因组编码区。在这里，我们提供了WGS的新见解，
显示最近引入的PCR-free WGS提供迄今为止前所未有的基因组编码区的全面覆盖
，因此WGS代替WES应该被认为是最全面的二线测试。
我们在五名女性的DNA样品中比较了最佳WES（使用Agilent SureSelect v5 + UTR捕获）和WGS（使用Illumina的TruSeq无PCR的WGS文库制备）。 测序由供应商分别在100×的HiSeq 2000和60×的HiSeq×Ten系统上进行。为了在很大程度上减少系统性错误和比对伪像，我们限制了唯一比对到X染色体或常染色体区域的RefSeq编码序列的比较，在hg19和hg38基因组组装中是相同的，并且不与常见的CNV重叠。
我们目前的数据显示，新型PCR-free的WGS对GC含量的敏感性要低得多，并且比WES和非PCR-free WGS的覆盖率更均匀（
游侠感觉也没比WGS with PCR高多少嘛😛
）。
虽然WGS平均覆盖深度比WES少一半（WGS为65X，而WES为154X），但在PCR-free的情况下，覆盖率≥100％，测序深度大于13X的RefSeq编码外显子的数目明显比WES更好（100.00% vs. 98.15％）。
此外，全基因组覆盖的均一性使得WGS而不是WES更适用于CNV检测。在我们的样本中，个体的外显子覆盖率的
变异系数（cv = SD / mean）WES 4倍于PCR-free的WGS（0.59vs. 0.14）
。不可否认的是，在WES中相对缺乏统一的覆盖度似乎并不是由于噪声水平的增加所致，因为每个外显子的个体间cv在WES和WGS中是差不多的（0.08对0.09），换句话说，WES覆盖范围的附加可变性似乎是可重复的，因此原则上可以通过数据分析实现归一化。然而，这样的归一化算法相对复杂，需要针对每个protocol进行单独校准。此外，瓦片样无缝WGS还提供基于
paired 和split reads
的结构变异（SV）的检测，并且
能够获得断裂点信息
。因此，在我们看来，WGS可能会取代微阵列技术检测CNV，而WES可能不会。
在世界范围内已经有许多能够提供至少60X 3X10
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bp的高通量测序能力的实验室以及合适的硬件和软件资源来处理和解释大型WGS数据文件。有人可能会说，WGS比选择性捕获测序的NGS更昂贵。 事实上，遗传嵌合体和肿瘤靶向测序需要几百倍的测序深度来检测低频变异，因此WGS对于这些应用来说目前太昂贵了，然而，
测序成本会稳步下降，数据解读可以通过计算机选择相关的WGS区域而缩减
。考虑到这些部分可能会发生变化，选择性捕获将需要对未解决的案例进行重新排序，而WGS只需对现有数据进行重新分析。此外，有人可能会争辩说，WGS意味着检测出与患者现有疾病无关突变的偶然发现以及不确定或不完全外显的变异，同样，
通过将WGS数据减少到感兴趣的虚拟Panel
，可以防止这种解读困难。因此，我们和其他人（Belkadi et al. 2015; Lelieveld et al. 2015）认为WGS在检测外显子组变异方面比WES强大，因此未来对孟德尔单基因遗传疾病的NGS诊断将不再涉及捕获技术。
总之，WES的性能对碱基GC含量以及捕获设计和富集非常敏感。因此，WES没有完全达到其目的，而新型PCR-free的WGS提供迄今为止前所未有完整覆盖的外显子组和其他临床相关的基因组区域。因此，
WGS的优势不仅包括识别非编码区致病性变异，而且鉴于其在本文中提供的更完整的外显子编码区覆盖，因此它是更好的“WES”
。因此，PCR-free的WGS必须被认为是最全面的二线基因组测试。随着测序成本的进一步下降，通过使用适当的虚拟Panel，WGS甚至有可能完全取代WES和涉及选择性捕获目标序列的其他技术
。
游侠点评：
将来的临床遗传病检测平台主流是WGS与医学外显子，WGS更全，医学外显子更有性价比还能检测低比例嵌合，期待illumina novaseq S4和华大测序价格下降。
