炎症性肠病（IBD）是一种涉及回肠、结肠和直肠的慢性肠道炎症，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，未能及时进行干预和治疗可能最终导致致癌或危及生命的并发症。工程菌疗法在治疗胃肠道疾病具有巨大的潜力，但其直接使用时会因强酸性胃液环境大量失活，且难以实现肠道定殖。因此，发展生物相容性好，能够耐受胃内强酸性环境，实现长时间肠道定殖的递送系统，对工程菌治疗IBD具有重要潜力。
针对以上挑战，刘润辉教授和叶邦策教授合作研发了一种治疗IBD的新策略，叶邦策教授课题组开发了一种针对IBD的智能工程菌，刘润辉教授课题组设计了一种黏液包封凝胶微球（mucus encapsulated microsphere，MM）递送系统。MM递送系统封装工程菌，维持工程菌在胃内的活力和肠道定殖，实现工程菌高效递送到病灶部位，且不影响生物标志物的进入和蛋白药物的释放，在炎症性肠病模型中表现出显著的诊断和治疗效果，为活体生物治疗产品向临床应用提供新的思路。
2024年12月4日，该研究成果以“Delivery of Encapsulated Intelligent Engineered Probiotic for Inflammatory Bowel Disease Therapy”为题发表在Advanced Healthcare Materials上（Adv. Healthcare Mater. 2024, 2403704. DOI: 10.1002/adhm.202403704）。刘润辉教授课题组前期研究发现的聚丝氨酸（PSer）材料具有优异的生物相容性，不引起明显的体内炎症反应和异物反应（Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 9586- 9593；Nat. Commun. 2021, 12, 5327；Adv. Funct. Mater. 2021, 31, 2007226）。作者将PSer引入到海藻酸（ALG）中，制备ALG-PSer（PA）凝胶微球包封工程菌。进一步地，制备表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和透明质酸（HA）组成的黏液层（EH），构建基于黏液-微球的MM递送系统（图1）。EGCG具有抗炎特性和表面黏附能力，HA具有优异的生物相容性和黏附性。MM递送系统能够有效保护工程菌抵御胃内的强酸性环境，显著提高工程菌在肠道的黏附，定殖时间超过20 h，且不影响生物标志物的进入和治疗性免疫调节蛋白Avcystatin的释放，在炎症性肠病动物模型中表现出优异的诊断和治疗效果。
本研究以益生性大肠杆菌Nissle 1917（EcN）作为底盘，开发用于诊断和治疗IBD的智能工程菌。该工程菌能够灵敏的感知IBD标志物血红素，产生生物发光的同时自调控的分泌AvCystatin用于疾病干预。为了实现对血红素介导的生物发光和治疗剂表达的精确控制，研究者对工程菌的功能元件进行了一系列迭代优化。最终，获得了名为EcN-LuxC-AvCys（ELA）的工程菌（图2A），其可以灵敏的感知血红素并自调控的分泌AvCystatin，检测限低于0.625 μM，最大诱导比167倍（图2B）。ELA发光响应的动力学显示，在血红素暴露后20分钟内信号快速放大，在120分钟时达到峰值（图2C）。成像结果和蛋白质印迹（WB）分析表明，生物发光强度及治疗蛋白的分泌水平和血红素浓度呈正相关（图2D）。此外，酶联免疫吸附测定（ELISA）结果表明AvCystatin的最大分泌量达到150 ng/mL（图2E）。这些结果表明成功构建了一种名为ELA的血红素响应型工程益生菌菌株，该菌株能够灵敏的感知血红素，产生强大的发光信号产生并自调控的释放治疗蛋白。
作者合成了聚DL-丝氨酸（PSer, Mn = 3700 Da, DP = 18, Ð = 1.12），然后以2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪（CDMT）和N-甲基吗啉（NMM）为偶联剂将PSer偶联到海藻酸钠上，进一步通过Ca2+交联法制备成微球并包封工程菌，微球呈椭球状，粒径分布均匀（图3A-E）。扫描电镜（SEM）图像进一步显示了工程菌在水凝胶微球内的有效封装（图3F）。模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF）处理2小时后，ELA@PA组的存活率达到82.7%，而未封装ELA组的存活率仅为4.11%（图3G）。随着SIF中孵育时间的增加，PA包封对ELA的保护作用更加明显，6 h时的存活率比未包封的细菌高23%（图3I）。连续暴露于模拟消化液后，PA的稳定包封使细菌存活率提高了约60%，表明其对ELA的保护作用增强（图3J）。体外黏附性能研究显示，PA+EH递送系统在猪结肠黏膜表面非常缓慢地向下流动，表现出很强的黏附性（图3K）。此外，PA+EH的包埋也不影响血红素与ELA的相互作用（图3L）。总之，PA+EH的包封可以在SGF或SIF环境中长时间保护工程菌，并维持细菌的应答能力。
图3. EH黏液包封PA微球凝胶给药系统的制备与表征为进一步评估递送体系的体内定植效果，作者分别让小鼠口服Cy5、ELA以及PA+EH包封的Cy5。成像分析显示PA+EH在体内的肠道滞留时间延长，超过20小时（图4A）。随后，我们对ELA@PA+EH的生物相容性和生物安全性进行了综合评价。细胞毒性实验结果表明，PA+EH包封显著降低了巨噬细胞对细菌的免疫识别（图4B）。给药5天，实验组和对照组之间小鼠体重、肝功能相关酶和细胞因子没有显著差异，H&E结肠组织切片未见免疫细胞浸润或其他炎症改变（图4C-F）。此外，作者还研究了ELA@PA+EH对小鼠肠道菌群的影响。结果显示ELA@PA+EH不会影响小鼠物种丰富度和多样性（图4G）。同时，有益菌群的比例，如拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteroidota）与对照组相当（图4H）。PA+EH独特的体内滞留特性和良好的生物相容性为胃肠道治疗提供了一种有潜力的递送系统。
肠出血的检测在监测IBD的发生和发展中起着至关重要的作用。为了评估ELA@PA+EH连续监测小鼠肠道炎症进展的能力，作者建立了两个模型，在小鼠结肠炎加重模型中（图5A），DSS给药第3天，发光信号显著增加，且随着疾病活动指数（DAI）的进展，发光信号继续增加（图5B、C）。接下来通过小鼠结肠炎缓解模型，继续研究ELA@PA+EH监测结肠炎恢复的能力（图5D）。结果显示ELA@PA+EH能有效检测小鼠结肠炎恢复期胃肠道出血减少情况（图5E、F）。
基于ELA的治疗性蛋白的表达能力以及MM递送系统提供的有效保护功效和肠道黏附能力，作者通过小鼠结肠炎缓解模型评估ELA@PA+EH在缓解DSS诱导的急性结肠炎方面的疗效（图6A）。与PBS（DSS+）组相比，ELA@PA+EH治疗显著减轻了小鼠体重下降，并伴有明显的疾病指数DAI的降低（图6B），而ELA组和EH组在DAI方面与PBS（DSS+）组相比没有改善（图6C）。此外，ELA@PA+EH（DSS+）组的结肠长度与健康小鼠相当，明显长于其它治疗组（图6D，E）。这些研究结果表明ELA@PA+EH与单纯ELA或EH治疗相比，在改善急性结肠炎方面有显著的疗效。结肠组织H&E染色显示ELA@PA+EH（DSS+）组与健康组相似，肠道结构完整，杯状细胞丰富，无炎症异常。而缺乏工程菌和MM递送系统均未显示粘膜上皮受损，淋巴细胞浸润，肠腺和杯状细胞数量减少（图6F）。此外，对结肠组织样本中促炎细胞因子（IFN-γ、IL-6和TNF-α）水平的评估显示，ELA@PA+EH（DSS+）组的细胞因子浓度显著低于PBS（DSS+）和EH组（DSS+）组（图6G-I）。有趣的是，ELA@PA+EH（DSS+）组和ELA（DSS+）组之间的促炎细胞因子水平无显著差异，这可能归因于EcN底盘和AvCystatin的抗炎特性。此外，作者还分析了第5天收集的粪便样本中的16S rRNA。PCoA和NMDS分析结果显示，与其他治疗相比，ELA@PA+EH治疗的结肠炎小鼠肠道菌群组成的β多样性更接近于健康组（图6J，K）。此外，ELA@PA+EH组显示有益菌的比例增加，有害菌比例下降（图6L，M）。这些发现均强调了ELA@PA+EH对IBD小鼠肠道微生物结构的有效治疗。
图6. ELA@PA+EH对DSS诱导小鼠结肠炎的缓解作用作者进一步利用DSS诱导的小鼠结肠炎治疗模型，研究ELA@PA+EH的治疗效果（图7A）。到第5天，所有DSS处理组的体重都减少了大约10%。然而，在治疗后两天内，ELA@PA+EH（DSS+）组的体重减轻速度减慢，体重迅速恢复，到第五天达到与健康组相当的水平（图7B）。此外，ELA@PA+EH（DSS+）组DAI较低，与健康PBS（DSS-）组无显著差异。结肠成像显示，ELA@PA+EH（DSS+）组的结肠长度比健康小鼠的结肠长度少1/2，且明显长于PBS（DSS+）组。结肠组织样本的细胞因子检测显示，ELA@PA+EH（DSS+）组与对照组相比无显著差异（图7E-G）。值得注意的是，与ELA@PA+EH（DSS+）组和ELA（DSS+）组在肠炎缓解实验中细胞因子水平无显著差异不同，在该治疗模型中，ELA@PA+EH（DSS+）组在促炎因子水平上与ELA（DSS+）组有显著差异。这种差异可能是由于治疗实验中灌胃次数减少所致。从这个角度来看，ELA@PA+EH的优势是显而易见的，因为它可以有效地抵御胃肠道的挑战，延长细菌定植时间，从而减少给药频率，从而减轻患者的负担。同样，PCoA和NMDS分析表明，ELA@PA+EH处理的结肠炎小鼠肠道微生物组成与健康小鼠相近（图7H，I）。ELA@PA+EH导致有益菌水平升高，有害菌水平降低（图7J，K）。这些结果表明，ELA@PA+EH处理抑制了有害微生物种群，同时为有益菌提供了更多的生存资源和环境生态位，从而促进了肠道微生物的稳态。总之，该研究结果为ELA@PA+EH通过调节肠道菌群多样性和恢复结肠炎小鼠有益菌和致病菌之间的平衡，在结肠炎治疗中的治疗潜力提供了令人信服的证据。
图7. ELA@PA+EH对小鼠DSS性结肠炎的治疗作用华东理工大学博士后邹振平、硕士研究生蔡志豪和张小芃是该论文的第一作者，华东理工大学叶邦策教授、刘润辉教授、周英教授和张东辉特聘副研究员是通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金委、科技部等基金的资助。
论文链接：
https://doi.org/10.1002/adhm.202403704
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