作者简介： 入行不深，3年有余。精雕技术，广不足而深有余。机器学习，好之适之点缀生信。 人称黑马王子，凡有涉猎，必得口令，便至臻境。 关于创作，外号“三不先生”：书上有的不写，别人写过的不写，自己写过的不重写。 篇篇原创，与君共赏。 |
VarScan2概述
VarScan2是华盛顿大学开发的一款多用途的call变异工具。可用于种系细胞、体细胞（SNV/INDEL/CNV/）(CNV不建议用，据说是别人提供的脚本，漏洞百出)、de Novo Mutations(trios))等。
VarScan2使用各种过滤方法，以得到各位点在样品中的基因型，并计算各等位基因的read 频率。此工具只支持两种等位基因的基因型。通过比较两个样品在该位点各等位基因的read 频率，并通过fisher’s检验得到差异显著性水平p 值。VarScan2工具将突变位点分为三种突变状态：somatic 突变、germline 突变、LOH 突变；并从三种状态的位点，得到置信位点。
以肿瘤对照样本为例，做下具体说明（推荐VarScan2，不要用varscan）：
mpileup文件生成
因为varscan使用pileup作为输入格式，我们需要先将bam处理为pileup格式，有2种方法
方法1：生成2个pileup文件
samtools mpileup -q 1 -d 30000 -L 30000 -f ucsc.hg19.fasta normal.bam > normal.pileup
samtools mpileup -q 1 -d 30000 -L 30000 -f ucsc.hg19.fasta tumor.bam > tumor.pileup
方法2：生成1个mpileup文件（官方文档强烈推荐）
samtools mpileup -q 1 -d 30000 -L 30000 -f ucsc.hg19.fasta normal.bamtumor.bam > normal.tumor.mpileup
参数说明：-q 1表示跳过比对的mapQ得分<1的碱基
-d 30000表示bam文件的最大测序深度为30000，这是考虑超深度测序的设置
-L 30000表示INDEL序列的最大测序深度为30000，这是考虑超深度测序的设置
备注：本人试过2种方法，方法1在后续的肿瘤变异calling时总是报错，是不是现在不能用了？建议用方法2。
肿瘤配对样本分析
Java -jar VarScan.v2.4.3.jar somatic normal.tumor.mpileup normal.tumor.vcf --mpileup 1 --output-vcf 1
参数说明：
--mpileup1表示采用mpileup文件
--output-vcf1 表示输出文件为vcf格式
结果文件：这里会生成normal.tumor.vcf.snp和normal.tumor.vcf.indel文件
靶向测序区域过滤：limit命令（许多人不知道该命令!拿去不谢！）
Java -jar VarScan.v2.4.3.jar limit normal.tumor.vcf.snp --regions-file regions.bed --output-file normal.tumor.vcf.target.snp
参数说明：--regions-file指定靶向测序分析的范围
变异过滤：processSomatic命令
Java -jar VarScan.v2.4.3.jar processSomatic normal.tumor.vcf.target.snp --min-tumor-freq 0.05 --max-normal-freq 0.15--p-value 0.07
参数说明：这里测序深度较深，所以--max-normal-freq0.15设置较大。
点评：
VarScan2在国内临床分析领域用得还是相当广的，不知其故？难道是变异结果文件分类很细的原因吗？如果只是因为方便而忽略准确性，我就只能呵呵了。
关于三大肿瘤工具的对比分析，请看下篇。
