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在《Cell Stem Cell》期刊发表的这篇文章中，来自荷兰的科研团队研究了人类肠道中的BEST4/CA7+细胞，这些细胞是通过单细胞RNA测序新近识别的。研究者们通过建立人类肠道类器官模型，首次在实验上探讨了这些细胞的功能。研究发现，BEST4/CA7+细胞的分化需要Notch信号通路和转录因子SPIB的激活。此外，细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）可以显著增加BEST4/CA7+细胞的数量，表明其在免疫中可能扮演角色。研究还显示，当受到细菌性腹泻毒素刺激时，BEST4/CA7+细胞会通过CFTR通道产生强烈的液体外流反应。研究者们还发现，去甲肾上腺素-ADRA2A轴可能是阻止BEST4/CA7+细胞介导的液体分泌的潜在机制。这些发现揭示了BEST4/CA7+细胞在细菌感染引起的液体稳态失衡中的核心作用。
BEST4/CA7+细胞是人类肠道上皮细胞的一小部分，具有独特的基因表达特征，如BEST4、SPIB、CA7和CFTR等基因，预测其在阴离子运输和酸感知中发挥作用。然而，由于小鼠肠道中缺乏相应的细胞类型，且人类体外模型的稀缺，BEST4/CA7+细胞的分化和功能尚未得到实验验证。细菌性腹泻毒素通过影响肠上皮的离子吸收或分泌，引发水分移动以恢复离子浓度平衡。CFTR作为一种已知的Cl−/HCO3−通道，是腹泻病原体的主要作用靶点之一。研究旨在通过创建基因改造的人类肠道类器官模型，探讨BEST4/CA7+细胞在电解质/液体稳态中的作用，并确认其作为细菌性腹泻毒素的细胞靶点。
荷兰科研团队在《Cell Stem Cell》期刊上发表了一篇关于人类肠道BEST4/CA7+细胞的研究论文。该研究利用单细胞RNA测序技术首次识别出BEST4/CA7+细胞，并通过建立人类肠道类器官模型，探讨了这些细胞在电解质平衡和免疫反应中的功能。研究发现，BEST4/CA7+细胞在细胞因子干扰素-γ的刺激下数量显著增加，表明其在免疫系统中可能扮演重要角色。此外，研究还揭示了BEST4/CA7+细胞在细菌性腹泻毒素刺激下，通过CFTR介导的液体外流机制，参与调节肠道液体稳态。
研究团队通过单细胞RNA测序技术识别出人类肠道中的BEST4/CA7+细胞，并开发了一种在体外人类肠道类器官中生成这些细胞的实验方法。研究发现，BEST4/CA7+细胞的分化需要Notch信号通路和转录因子SPIB的激活。这些细胞在受到细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）刺激时数量显著增加，表明其在免疫反应中可能发挥作用。实验表明，BEST4/CA7+细胞在受到细菌性腹泻毒素刺激时会产生强烈的CFTR介导的液体流出，并且去甲肾上腺素-ADRA2A轴可能通过阻止这些细胞的液体分泌来发挥作用。BEST4/CA7+细胞在肠道液体稳态中扮演重要角色，尤其是在细菌感染引起的腹泻反应中。研究表明，BEST4/CA7+细胞是细菌性腹泻毒素的主要靶点，能够通过CFTR通道调节电解质和液体的分泌。研究还发现，IFN-γ可以通过增加BEST4/CA7+细胞的数量来增强细菌毒素引起的电解质和水分释放，这表明这些细胞在细菌感染防御中可能具有重要作用。
细菌性腹泻的潜在治疗靶点：BEST4/CA7+细胞在肠道中对电解质/液体平衡的调节起关键作用。这些细胞被细菌毒素靶向，导致腹泻，这提示它们可能是治疗细菌性腹泻的新靶点。通过调节这些细胞的功能或数量，可能有助于控制腹泻症状。 免疫反应中的作用：研究显示，BEST4/CA7+细胞对干扰素-γ（IFN-γ）具有响应性，这表明它们在细菌感染中可能发挥免疫功能。这种发现为理解肠道上皮细胞如何参与免疫反应提供了新的视角，可能会影响未来肠道疾病的免疫治疗策略。 新型研究模型的建立：通过人肠道类器官模型成功生成BEST4/CA7+细胞，为未来的研究提供了一个强有力的工具。这可以加速对肠道细胞在疾病和健康状态下功能的研究。总体而言，这项研究揭示了BEST4/CA7+细胞在肠道液体平衡和免疫反应中的重要性，为细菌性腹泻的潜在新疗法提供了科学依据。
1. 建立人类肠道类器官模型： 作者首先开发了一种培养方案，使得BEST4/CA7+细胞能够在人体肠道类器官中生成。这涉及去除自我更新因子以促进干细胞向多种细胞谱系的分化。
2. 使用基因编辑技术创建报告器类器官： 通过CRISPR-Cas9技术，在CA7基因的C端引入P2A-tdTomato标签，生成BEST4/CA7+细胞的标记类器官。这种策略允许对BEST4/CA7+细胞进行可视化和分选。
3. 验证重要信号通路的作用： 通过添加或抑制不同的信号因子（如Notch信号、mTOR信号），研究其对BEST4/CA7+细胞生成的影响，发现Notch信号对BEST4/CA7+细胞的生成至关重要。
4. SPIB基因功能验证：使用CRISPR技术敲除SPIB基因，观察其在BEST4/CA7+细胞分化中的关键作用，进一步通过SPIB过表达恢复实验验证SPIB的功能。
5. 细胞群扩增和免疫反应性研究：通过细胞因子（如IFN-γ）处理，观察BEST4/CA7+细胞的扩增反应，揭示其作为免疫反应性细胞的特性。
6. 细胞功能和信号通路分析：利用类器官肿胀实验（organoid swelling assay），研究BEST4/CA7+细胞在细菌腹泻毒素（如霍乱毒素和STa类似物）作用下的电解质/液体平衡调节功能。
7. 单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析：对处理过的和未处理的类器官进行scRNA-seq分析，研究BEST4/CA7+细胞在不同条件下的基因表达变化，以揭示其在炎症信号下的转录组特征。
图1：含有BEST4/CA7+细胞的人类肠道类器官模型
图1展示了人类肠道类器官模型中BEST4/CA7+细胞的存在及其特征。A. 该小图展示了类器官扩增和分化的示意图，列出了类器官扩增和分化所需的培养基成分，并指明了培养类器官中的代表性细胞类型。B. 为了分析BEST4/CA7+细胞标志物在结肠类器官中的表达，作者对在扩增或分化培养基中培养的结肠类器官进行了qPCR分析，结果显示在分化培养基中，BEST4/CA7+细胞标志物的表达水平更高。C和D. 通过全装免疫荧光染色法，作者对在分化培养基中培养的结肠和小肠类器官进行了观察，BEST4/CA7+细胞被标记为绿色，结果显示在分化培养基中，BEST4/CA7+细胞在结肠和小肠类器官中均有分布。结论：该图展示了在分化培养基中培养的人类肠道类器官中，BEST4/CA7+细胞的存在及其特征，表明这种培养条件有助于BEST4/CA7+细胞的分化和标志物的表达。
图2：使用敲入报告基因类器官对BEST4/CA7+细胞的特征进行分析
图2为了研究BEST4/CA7+细胞的特征，作者构建了含有P2A-tdTomato盒的敲入报告基因类器官，并在分化培养基中进行培养和分析。A. 为了研究CA7基因的表达，作者在CA7基因的C末端插入了P2A-tdTomato盒，构建了敲入报告基因类器官。这个设计允许通过荧光标记来追踪CA7基因的表达。B. 在分化培养基中培养的CA7-P2A-tdTomato报告基因类器官的代表性图像显示，CA7基因的表达可以通过tdTomato荧光信号进行可视化。C. 通过流式细胞术分析了在分化培养基中培养的CA7-P2A-tdTomato报告基因类器官中BEST4/CA7+细胞的百分比。结果表明，分化培养基中存在一定比例的BEST4/CA7+细胞。D. 对分选后的tdTomato+和tdTomato−细胞进行了qPCR分析，以检测BEST4/CA7+细胞标志物的表达。结果显示，tdTomato+细胞中BEST4/CA7+细胞标志物的表达显著高于tdTomato−细胞。E. 对分化培养基中生长的结肠类器官来源的329个细胞进行了单细胞RNA测序分析。结果揭示了这些细胞的转录组特征，为进一步研究BEST4/CA7+细胞提供了基础数据。结论：通过构建含有P2A-tdTomato盒的敲入报告基因类器官，成功实现了对BEST4/CA7+细胞的特征分析，揭示了其在分化培养基中的表达和转录组特征。
图3：BEST4/CA7+细胞分化的Notch依赖性
图3研究了BEST4/CA7+细胞分化过程中对Notch信号通路的依赖性。A-C. 通过流式细胞术分析和定量，作者对CA7-P2A-tdTomato报告基因标记的类器官进行了研究，分别在分化培养基中培养，或在分化过程中添加不同的微环境因子。结果显示，添加不同的微环境因子对BEST4/CA7+细胞的分化有显著影响。D. 通过显微镜观察，作者对在分化培养基中培养的CA7-P2A-tdTomato报告基因标记的类器官进行了成像，或在分化过程中添加DAPT。结果表明，添加DAPT显著影响了细胞的分化状态。E-F. 作者构建了CA7-P2A-tdTomato和MUC2-mNeonGreen双报告基因标记的类器官，并在分化培养基中进行培养。通过示意图和显微镜成像，展示了双报告基因标记的类器官在分化培养基中的表现。结论：BEST4/CA7+细胞的分化过程对Notch信号通路具有依赖性，添加不同的微环境因子或DAPT会显著影响细胞的分化状态。
图4：SPIB敲除类器官中缺乏BEST4/CA7+细胞
图4探讨了SPIB基因敲除对类器官中BEST4/CA7+细胞的影响。A. 为了观察SPIB基因敲除对类器官中细胞分化的影响，作者使用CA7-P2A-tdTomato和MUC2-mNeonGreen双报告基因标记的类器官进行成像。结果显示，在SPIB敲除的类器官中，BEST4/CA7+细胞的分化受到影响。B-C. 通过流式细胞术分析和定量，作者比较了野生型和SPIB敲除的双报告基因类器官中BEST4/CA7+细胞的比例。结果表明，在SPIB敲除的类器官中，BEST4/CA7+细胞的数量显著减少。D-E. 为了验证SPIB基因的作用，作者在SPIB敲除的报告基因类器官中，通过Dox诱导SPIB的过表达，进行流式细胞术分析和定量。结果显示，SPIB的过表达可以部分恢复BEST4/CA7+细胞的分化。F. 使用CA7-P2A-tdTomato报告基因标记的类器官进行成像，进一步验证SPIB敲除对细胞分化的影响，结果与A中的观察一致。G. 通过qPCR分析，作者检测了野生型和SPIB敲除类器官中BEST4/CA7+细胞标记基因的表达。结果显示，SPIB敲除导致这些标记基因的表达显著下降。结论：SPIB基因在类器官中BEST4/CA7+细胞的分化中起关键作用，其敲除会导致这些细胞的缺失，而SPIB的过表达可以部分恢复其分化。
图5：BEST4/CA7+细胞对1型免疫因子IFN-γ的响应性扩增
图5研究了1型免疫因子IFN-γ对BEST4/CA7+细胞扩增的影响。A. 为了研究IFN-γ对BEST4/CA7+细胞的影响，作者使用流式细胞术分析了在分化培养基中培养的CA7-P2A-tdTomato报告基因类器官，以及在分化过程中添加IFN-γ后的类器官。结果显示，添加IFN-γ后，BEST4/CA7+细胞的比例增加。B. 作者通过流式细胞术定量分析了在分化培养基中培养的CA7-P2A-tdTomato报告基因类器官，以及在分化过程中添加不同炎症因子后的类器官中BEST4/CA7+细胞的比例。结果表明，IFN-γ显著增加了BEST4/CA7+细胞的比例，而其他炎症因子没有类似效果。C. 作者通过流式细胞术定量分析了在不同天数的分化培养中，是否添加IFN-γ对CA7-P2A-tdTomato报告基因类器官中BEST4/CA7+细胞比例的影响。结果显示，随着时间的推移，IFN-γ处理组的BEST4/CA7+细胞比例持续增加。D. 作者通过流式细胞术定量分析了不同剂量的IFN-γ对分化后的CA7-P2A-tdTomato报告基因类器官中BEST4/CA7+细胞比例的影响。结果表明，BEST4/CA7+细胞的比例随着IFN-γ剂量的增加而增加。E. 作者提供了CA7-P2A-tdTomato; MUC2-mNeonGreen双报告基因类器官的代表性图像，这些类器官在分化培养基中培养或在分化过程中添加IFN-γ。结果显示，添加IFN-γ后，BEST4/CA7+细胞的荧光信号增强，表明细胞扩增。结论：1型免疫因子IFN-γ能够显著促进BEST4/CA7+细胞的扩增，且其效果与IFN-γ的剂量和处理时间相关。
图6：BEST4/CA7+ 细胞调控电解质/液体稳态
图6旨在探讨BEST4/CA7+ 细胞在电解质和液体稳态中的作用，特别是在细菌性腹泻毒素诱导的液体分泌中的作用。A-B. 为了检测CFTR和GUCY2C在人体小肠中的表达，作者使用针对CFTR或GUCY2C的抗体进行免疫组化染色。结果显示，这些蛋白在小肠组织中的特定区域表达，提示它们可能在肠道液体和电解质平衡中发挥重要作用。C. 作者设计了一个实验模型，使用类器官肿胀实验模拟细菌性腹泻毒素诱导的液体分泌。该模型用于研究肠道在不同刺激下的反应。D-E. 通过时间推移图像和定量分析，研究了STa类似物利那洛肽对类器官腔体积相对变化的影响。结果表明，利那洛肽刺激后，类器官腔体积显著增加，表明液体分泌增加。F-G. 通过时间推移图像和定量分析，研究了霍乱毒素对类器官腔体积相对变化的影响。结果显示，霍乱毒素刺激后，类器官腔体积显著增加，进一步支持其在液体分泌中的作用。结论：BEST4/CA7+ 细胞通过调控CFTR和GUCY2C等蛋白质，参与电解质和液体稳态的维持，并在细菌性腹泻毒素诱导的液体分泌中发挥关键作用。
