基于ITS2条形码鉴别市售柴胡药材及其混伪品

柴胡原名茈胡，始载于《神农本草经》，列为上品 ^[1] ，具有良好的药用价值和经济价值，是我国传统中药材之一。《中国药典》 2015 年版规定，柴胡为伞形科植物柴胡 Bupleurum chinense DC. 或狭叶柴胡 B . scorzonerifolium Willd. 的干燥根。按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”。柴胡有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气之功效 ^[2] 。现代药理研究证明，柴胡具有抗炎、抗病毒、保肝利胆、防治癌症等作用，以柴胡为主要原料的药品以多种剂型在临床应用 ^[3] 。据统计，柴胡属植物在我国共有 42 种、 17 变种、 7 变型，其中有 25 种、 8 变种、 3 变型在我国不同地区作为柴胡入药，有的地区甚至把 5 、 6 种柴胡属植物混在一起用，导致药材市场严重混乱 ^[4-5] 。近年来柴胡市场需求量不断增大，而药用资源却逐年减少，利益驱使以假乱真、以次充好的现象不断出现，药材质量参差不齐，严重影响用药安全 ^[6] 。市场上已出现苦参 Sophora flavescens Ait . 、 龙牙草 Ag rimonia pilosa Ldb. 、 石竹 Dianthus chinensis L . 等伪品冒充柴胡药材 ^[7] ，鉴别市场药材迫在眉睫。传统的鉴别方法主要从基原、性状、显微、理化等方面进行区分，对操作人员的专业知识要求较高，同时对准确鉴别药材饮片来源有一定局限性，因此选择一种科学的鉴定方法来快速准确地鉴别柴胡市场药材，对于安全合理用药具有重要意义。

DNA 条形码是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的 DNA 片段来进行物种鉴定的分子诊断新技术，是传统形态鉴别方法的辅助手段和有效补充 ^[8] ，可以实现对生物物种的准确、快速鉴别。 Chen 等 ^[9-11] 提出以 ITS2 作为鉴别植物的通用序列，并在多个科属中验证了其稳定性 ^[12-17] ， 2010 年国家药典委员会将中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则纳入《中国药典》增补本。已有文献报道称 ITS 和 ITS2 片段适合于柴胡物种的鉴定，于俊林等 ^[18] 应用 ITS2 条形码准确鉴定柴胡及大叶柴胡； Chao 等 ^[19] 应用 ITS2 、 psbA-trnH 、 matK 和 rbcL 4 个条形码对柴胡属 19 个物种 51 个样品进行鉴定并验证条形码的适用性，结果表明以 ITS2 为核心、 psbA-trnH 为补充序列具有较高的鉴别准确率，但 4 个片段均不能成功鉴别北柴胡和银州柴胡；袁伯川等 ^[20] 利用 ITS 序列可快速准确地鉴定柴胡和银州柴胡。本实验选用 ITS2 片段，对从全国 19 个省市收集的 85 份市售柴胡药材进行真伪鉴别，为规范中药材市场以及保障柴胡的安全合理用药提供依据。

1 材料

本研究 85 份柴胡及其混伪品的样品分别购自全国 19 个省市中药材市场，全部为药材干根，于 20 ℃ 保存备用。样品经沈阳药科大学中药学院路金才教授鉴定，从外观性状上看，有部分样品不属于《中国药典》 2015 年版规定的柴胡药材正品来源，遂用 DNA 条形码进行鉴定。标本凭证保存在沈阳药科大学中药学院，样品信息见表 1 。

2 方法

2.1 DNA 提取

用 75% 乙醇擦拭药材表面，自然晾干。刮去外表皮，取药材约 40 mg ，用 DNA 提取研磨仪（ Retsch MM400 ，德国）研磨 2 min （ 1 800 r/min ），利用植物基因组 DNA 提取试剂盒 plant genomic DNA kit （北京天根生化科技有限公司）提取样品总 DNA 。

2.2 PCR 扩增和测序

PCR 扩增选用通用引物， ITS2F （ 5’-ATGCGATACTTGGTGAAT-3’ ）、 ITS3R （ 5’-GACCCTTCTCCAGACTACAAT-3’ ）。 PCR 扩增体系为 25 μL ，包含 2 × Taq PCR Master Mix （上海生工生物工程股份有限公司） 12.5 μL ， ddH ₂ O 8.5 μL ，正、反向引物各 1 μL （ 2.5 μmol/L ，上海生工生物工程股份有限公司），基因组 DNA 2 μL 。 PCR 扩增程序为 94 ℃ 、 5 min ； 94 ℃ 、 30 s ， 56 ℃ 、 30 s ， 72 ℃ 、 45 s ， 40 个循环； 72 ℃ 、 10 min 。 PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测结果，送往美吉生物医药科技有限公司进行双向测序。

2.3 数据处理

应用 CodonCodeAligner 对测序峰图进行校对拼接，去除引物及低质量区。基于隐马尔可夫模型的 HMMer 注释方法 ^[21] ，去除两端 5.8S 和 28 S 区段即可获得 ITS2 间隔区序列。利用 MEGA （ molecularevolutionary genetics analysis ） 6.0 进行序列比对，计算 GC 量和种内、种间 Kimura 2-parameter （ K2P ）遗传距离，利用邻接法（ neighbour-joining ， NJ ）构建系统聚类树，同时以 bootstrap （自展支持率 1 000 次）重复检验各分支的支持率。根据 ITS2 数据库网站预测其 ITS2 二级结构。

3 结果与分析

3.1 基于 ITS2 序列的物种鉴定结果

将注释得到的 85 条 ITS2 序列在中药材 DNA 条形码鉴别系统和 GenBank 数据库中进行相似性搜索（ BLAST ）鉴定，结果表明 ITS2 序列能够准确鉴定柴胡及其混伪品， 54 条为柴胡， 1 条为狭叶柴胡， 6 条为锥叶柴胡， 3 条为黑柴胡， 3 条为柴首， 1 条为三岛柴胡， 1 条为紫花鸭趾柴胡； 16 条序列不属于柴胡属，其中 7 条为当归， 9 条为田葛缕子。 85 份样品中， 55 份药材符合《中国药典》 2015 年版规定的柴胡正品来源，正品率为 64.7% 。将获得的 85 条 ITS2 序列提交至 GenBank 数据库并获得登录号，见表 1 。

3.2 柴胡及其混伪品的 ITS2 序列长度及变异位点分析

柴胡及其混伪品的 ITS2 序列特征见表 2 ，其中柴胡的 54 条 ITS2 序列有 4 个变异位点，共有 5 个（ A ₁ ～ A ₅ ）单倍型（表 3 ），单倍型 A ₁ 包括 30 条序列，单倍型 A ₂ 包括 1 条序列，单倍型 A ₃ 包括 4 条序列，单倍型 A ₄ 包括 18 条序列，单倍型 A ₅ 包括 1 条序列。本研究中得到的柴胡主要单倍型 A ₁ 及狭叶柴胡的一个单倍型均与陈士林主编的《中国药典中药材 DNA 条形码标准序列》 ^[22] 介绍的主导单倍型 完全一致。柴胡与其同属混伪品间的变异位点主要集中在第 9 、 108 、 141 、 143 、 162 、 193 、 195 位点，与柴首的变异位点较多，与田葛缕子、当归的序列几乎完全不同，见图 1 。

3.3 柴胡药材种内 、 种间遗传距离及 NJ 树

柴胡种内平均 K2P 遗传距离为 0.001 ，种内最大 K2P 遗传距离为 0.008 7 ；柴胡属内种间平均 K2P 遗传距离为 0.018 7 ，种间最小 K2P 遗传距离 0.018 2 。柴胡种间最小遗传距离明显大于种内最大遗传距离。基于 ITS2 序列构建柴胡及其混伪品间的 NJ 系统聚类树（图 2 ）。从聚类树上可以明显看出，伪品田葛缕子、当归和柴胡属分别单独聚类，说明它们与柴胡亲缘关系较远较易区分。柴胡属内 7 个物种又单独聚为 7 小支，且各支支持率较高，具有良好的单系性，说明该方法同样适用于亲缘关系较近的柴胡属内各物种的鉴别。

3.4 柴胡及其混伪品的 ITS2 二级结构比较

柴胡及其混伪品的 ITS2 序列二级结构（图 3 ）均由 1 个中心环 4 个螺旋区组成，每个螺旋上又有大小不等、数目各异的茎环结构。其中柴胡中心环较大，螺旋 II 区有 1 个环， IV 区有 2 个环，能够区别于其他混伪品；三岛柴胡的中心环比较复杂也容易区分。狭叶柴胡、锥叶柴胡、黑柴胡、柴首、紫花鸭趾柴胡的二级结构在螺旋