柴胡原名茈胡，始载于《神农本草经》，列为上品[1]，具有良好的药用价值和经济价值，是我国传统中药材之一。《中国药典》2015年版规定，柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC. 或狭叶柴胡B. scorzonerifoliumWilld. 的干燥根。按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”。柴胡有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气之功效[2]。现代药理研究证明，柴胡具有抗炎、抗病毒、保肝利胆、防治癌症等作用，以柴胡为主要原料的药品以多种剂型在临床应用[3]。据统计，柴胡属植物在我国共有42种、17变种、7变型，其中有25种、8变种、3变型在我国不同地区作为柴胡入药，有的地区甚至把5、6种柴胡属植物混在一起用，导致药材市场严重混乱[4-5]。近年来柴胡市场需求量不断增大，而药用资源却逐年减少，利益驱使以假乱真、以次充好的现象不断出现，药材质量参差不齐，严重影响用药安全[6]。市场上已出现苦参Sophora flavescens Ait.、龙牙草Agrimonia pilosa Ldb.、石竹Dianthus chinensis L. 等伪品冒充柴胡药材[7]，鉴别市场药材迫在眉睫。传统的鉴别方法主要从基原、性状、显微、理化等方面进行区分，对操作人员的专业知识要求较高，同时对准确鉴别药材饮片来源有一定局限性，因此选择一种科学的鉴定方法来快速准确地鉴别柴胡市场药材，对于安全合理用药具有重要意义。
DNA条形码是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断新技术，是传统形态鉴别方法的辅助手段和有效补充[8]，可以实现对生物物种的准确、快速鉴别。Chen等[9-11]提出以ITS2作为鉴别植物的通用序列，并在多个科属中验证了其稳定性[12-17]，2010年国家药典委员会将中药材DNA条形码分子鉴定指导原则纳入《中国药典》增补本。已有文献报道称ITS和ITS2片段适合于柴胡物种的鉴定，于俊林等[18]应用ITS2条形码准确鉴定柴胡及大叶柴胡；Chao等[19]应用ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL 4个条形码对柴胡属19个物种51个样品进行鉴定并验证条形码的适用性，结果表明以ITS2为核心、psbA-trnH为补充序列具有较高的鉴别准确率，但4个片段均不能成功鉴别北柴胡和银州柴胡；袁伯川等[20]利用ITS序列可快速准确地鉴定柴胡和银州柴胡。本实验选用ITS2片段，对从全国19个省市收集的85份市售柴胡药材进行真伪鉴别，为规范中药材市场以及保障柴胡的安全合理用药提供依据。
1 材料
本研究85份柴胡及其混伪品的样品分别购自全国19个省市中药材市场，全部为药材干根，于20 ℃保存备用。样品经沈阳药科大学中药学院路金才教授鉴定，从外观性状上看，有部分样品不属于《中国药典》2015年版规定的柴胡药材正品来源，遂用DNA条形码进行鉴定。标本凭证保存在沈阳药科大学中药学院，样品信息见表1。
2 方法
2.1 DNA提取
用75%乙醇擦拭药材表面，自然晾干。刮去外表皮，取药材约40 mg，用DNA提取研磨仪（Retsch MM400，德国）研磨2 min（1 800 r/min），利用植物基因组DNA 提取试剂盒plant genomic DNA kit（北京天根生化科技有限公司）提取样品总DNA。
2.2 PCR扩增和测序
PCR扩增选用通用引物，ITS2F（5’-ATGCGATACTTGGTGAAT-3’）、ITS3R（5’-GACCCTTCTCCAGACTACAAT-3’）。PCR扩增体系为25 μL，包含2×Taq PCR Master Mix（上海生工生物工程股份有限公司）12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，正、反向引物各1 μL（2.5 μmol/L，上海生工生物工程股份有限公司），基因组DNA 2 μL。PCR扩增程序为94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、45 s，40个循环；72 ℃、10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果，送往美吉生物医药科技有限公司进行双向测序。
2.3 数据处理
应用CodonCodeAligner对测序峰图进行校对拼接，去除引物及低质量区。基于隐马尔可夫模型的HMMer 注释方法[21]，去除两端5.8S和28 S区段即可获得ITS2间隔区序列。利用MEGA（molecularevolutionary genetics analysis）6.0进行序列比对，计算GC量和种内、种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离，利用邻接法（neighbour-joining，NJ）构建系统聚类树，同时以bootstrap（自展支持率1 000次）重复检验各分支的支持率。根据ITS2数据库网站预测其ITS2二级结构。
3 结果与分析
3.1 基于ITS2序列的物种鉴定结果
将注释得到的85条ITS2序列在中药材DNA条形码鉴别系统和GenBank数据库中进行相似性搜索（BLAST）鉴定，结果表明ITS2序列能够准确鉴定柴胡及其混伪品，54条为柴胡，1条为狭叶柴胡，6条为锥叶柴胡，3条为黑柴胡，3条为柴首，1条为三岛柴胡，1条为紫花鸭趾柴胡；16条序列不属于柴胡属，其中7条为当归，9条为田葛缕子。85份样品中，55份药材符合《中国药典》2015年版规定的柴胡正品来源，正品率为64.7%。将获得的85条ITS2序列提交至GenBank数据库并获得登录号，见表1。
3.2 柴胡及其混伪品的ITS2序列长度及变异位点分析
柴胡及其混伪品的ITS2序列特征见表2，其中柴胡的54条ITS2序列有4个变异位点，共有5个（A1～A5）单倍型（表3），单倍型A1包括30条序列，单倍型A2包括1条序列，单倍型A3包括4条序列，单倍型A4包括18条序列，单倍型A5包括1条序列。本研究中得到的柴胡主要单倍型A1及狭叶柴胡的一个单倍型均与陈士林主编的《中国药典中药材DNA条形码标准序列》[22]介绍的主导单倍型完全一致。柴胡与其同属混伪品间的变异位点主要集中在第9、108、141、143、162、193、195位点，与柴首的变异位点较多，与田葛缕子、当归的序列几乎完全不同，见图1。
3.3 柴胡药材种内、种间遗传距离及NJ树
柴胡种内平均K2P遗传距离为0.001，种内最大K2P遗传距离为0.008 7；柴胡属内种间平均K2P遗传距离为0.018 7，种间最小K2P遗传距离0.018 2。柴胡种间最小遗传距离明显大于种内最大遗传距离。基于ITS2序列构建柴胡及其混伪品间的NJ系统聚类树（图2）。从聚类树上可以明显看出，伪品田葛缕子、当归和柴胡属分别单独聚类，说明它们与柴胡亲缘关系较远较易区分。柴胡属内7个物种又单独聚为7小支，且各支支持率较高，具有良好的单系性，说明该方法同样适用于亲缘关系较近的柴胡属内各物种的鉴别。
3.4 柴胡及其混伪品的ITS2二级结构比较
柴胡及其混伪品的ITS2序列二级结构（图3）均由1个中心环4个螺旋区组成，每个螺旋上又有大小不等、数目各异的茎环结构。其中柴胡中心环较大，螺旋II区有1个环，IV区有2个环，能够区别于其他混伪品；三岛柴胡的中心环比较复杂也容易区分。狭叶柴胡、锥叶柴胡、黑柴胡、柴首、紫花鸭趾柴胡的二级结构在螺旋II、IV区较为保守，螺旋I、III区有差异。狭叶柴胡在I区有4个环，III区有7个环；锥叶柴胡在I区有5个环，III区有7个环；黑柴胡在I区有3个环，III区有8个环；柴首在I区有5个环，III区有7个环；紫花鸭趾柴胡在I区有4个环，III区有9个环。锥叶柴胡和柴首在螺旋I、III区的茎环数目虽然相等，但环的大小、环与环之间的距离都有差异。伪品田葛缕子、当归与柴胡的最大区别在于螺旋II区，柴胡只有1个环，田葛缕子、柴胡都有2个环。田葛缕子、当归和柴胡属其他物种的最大区别在于III区，田葛缕子有5个环，当归有4个环，少于柴胡属其他物种在III区的茎环个数。可见，通过ITS2序列的二级结构也能够准确地鉴别柴胡药材与其混伪品。
4 讨论
4.1 柴胡药材基因组DNA的提取
在整个实验过程中，获得高质量的DNA是进行DNA条形码鉴定的必要前提，柴胡药材为根部入药，与土壤中真菌接触较多，为避免污染、提高鉴别的准确性和稳定性，实验前用75%乙醇擦拭药材表面，自然晾干，去除外表皮。提取DNA时，基原植物样本用量较少，为20mg，鉴于本研究选用的实验材料为市售药材，一般为干根或经过简单加工处理的药材饮片，为提高提取的DNA浓度，样品量增加至40 mg。另外在DNA提取过程中，通过适当增加水浴时间，使细胞充分裂解，也可使提取的DNA达到较高浓度。
4.2 ITS2序列鉴定柴胡药材及其混伪品的可行性
作为DNA条形码鉴别序列，首要标准就是要有足够的种间变异，可将不同物种区分开来，同时又要有较小的种内差异，可将同一物种聚为同一类。本研究中，通过ITS2序列计算的柴胡与其混伪品间的种间最小遗传距离明显大于柴胡种内最大遗传距离，说明利用ITS2序列可以准确鉴别柴胡药材及其混伪品。基于ITS2序列构建的NJ树，不同物种表现出良好的单系性，各支支持率较高，以及根据ITS2序列预测的二级结构，不同物种均有很大差别，而且本实验中收集的85份药材，均成功获得高质量ITS2序列，说明ITS2序列片段用于鉴别柴胡药材及其混伪品拥有良好的稳定性。
4.3 利用DNA条形码鉴别市售药材的意义
本研究85份样品中，55份药材符合《中国药典》2015年版规定的柴胡正品来源，正品率仅为64.7%。鉴定的样品中除柴胡和狭叶柴胡外，还包括柴胡属其他5个品种，说明柴胡中药材市场来源混乱，药材质量参差不齐，存在极大的用药安全隐患，鉴别市售药材具有非常显著的意义。药材中还掺杂了当归、田葛缕子等伪品，这些药材原植物与柴胡外观性状上虽有很大差别，但以根入药后就很难区分，药性也大不相同，在药材市场里混作柴胡，误用后将产生不良反应或者毒副作用，严重者可能危及生命安全。DNA条形码技术具有快速、准确、微量、通用性强的特点，不受发育阶段、供试部位、环境条件的影响，可以鉴别药材外部形态不完整或已被加工成粉末、饮片的样品，弥补了传统鉴别方法在这方面的不足，在中药鉴定中展示了更加广阔的应用前景。随着中药现代化研究的不断发展，DNA条形码分子鉴定技术将在中药材流通、市场监管方面得到推广应用，帮助临床安全合理用药。
参考文献（略）
来 源：王亚丹，韩晓妮，赵玉丹，雷天莉，韩 凌，张跃飞，路金才. 基于ITS2条形码鉴别市售柴胡药材及其混伪品 [J]. 中草药, 2017, 48(17):3590-3597.
