在免疫研究的浩瀚海洋中，T细胞耗竭一直是备受瞩目的关键领域，尤其是在慢性感染和肿瘤的研究中占据着核心地位。长久以来，科学界普遍认为，耗竭T细胞及其前体的产生依赖于持续的抗原暴露和炎症刺激，这一观点如同铁律般深入人心。然而，今天要为大家带来一项具有颠覆性的研究成果，它宛如一颗璀璨的新星，照亮了T细胞耗竭研究的新方向。这篇研究发表在Nature（IF=50.5）杂志上，题名为 “Precursors of exhausted T cells are preemptively formed in acute infection 急性感染时会预先形成衰竭T细胞的前体”。
研究团队以敏锐的科研洞察力和勇于探索的精神，将目光投向了急性感染这一相对未被充分挖掘的领域。他们巧妙地利用公共单细胞RNA-Seq数据集 GSE119943。在这个数据集中，淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒特异性（LCMV）、TCR 转基因P14 T细胞被转移到宿主小鼠体内，随后小鼠遭受急性LCMV感染，以此构建了病毒感染小鼠模型。研究人员如同技艺精湛的工匠，对感染后4.5天和7天的P14 T细胞进行了细致分析，成功地识别出了八个具有截然不同基因表达特征的细胞簇（图1A）。
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簇4-8宛如一群训练有素的士兵，展现出典型的急性感染效应细胞的特征（图1B）。它们高表达Id2，效应分子（Gzmb、Gzma、Gzmk、Ifng、Tnf）的表达水平也各有差异，仿佛在诉说着它们在免疫反应中的独特作用。簇4中的细胞在第7天表现出的转录特征与终末效应细胞极为相似，就像是一群经验丰富的老将，基因Klrg1和颗粒酶（Gzma、Gzmk）水平显著升高，随时准备投入战斗。簇 5（第7天）和簇 6（第 4.5 天和7天）则像是初出茅庐的新兵，具有早期效应细胞的表型，虽然也表达颗粒酶，但Klrg1的表达相较于第7天的终末效应细胞明显较低。簇 7（第 4.5 天）和簇 8（第 4.5 天和7天）则像是充满活力的年轻战士，富含循环效应细胞，细胞周期相关基因（Mki67、Cks2、Mad2l1 和 Ccnb1）上调，其中簇7更是在这场免疫之战中表现突出，表达着最高水平的Ifng、Tnfa和Havcr2。
与这些效应细胞簇形成鲜明对比的是，簇1中的细胞宛如一群智慧的谋士，具有记忆前体细胞的转录特征。它们表达着 Tcf7、Il7r、Sell 和 Id3 等关键基因，而 Klrg1、Gzma、Gzmk 和 Tbx21 等效应分子的表达则被巧妙地抑制，仿佛在默默地为免疫记忆的形成积蓄力量。簇2（第 4.5 天）则像是一个独特的混合体，兼具祖细胞（Tcf7、Slamf6 和 Id3）和T细胞耗竭（Xcl1、Pdcd1 和 Tox）的标记物，这种独特的组合让人不禁对其在免疫过程中的角色充满好奇。第 4.5 天的簇3细胞更是如同被点燃的烽火，表达着高水平的早期激活标记物，如 Xcl1、Myc，以及耗竭相关基因 Pdcd1、Tox、Tnfrsf9（4-1BB）、Myb 和 Havcr2（TIM-3），但传统效应分子（Id2、Tbx21、Cxcr6、Ccr5）和颗粒酶的表达量却相对较低，仿佛在发出一种独特的信号，暗示着它们在T细胞耗竭进程中的特殊地位。这些发现如同在平静的湖面投下了一颗巨石，激起了研究人员深入探索这些细胞起源和命运的强烈兴趣。
为了更深入地了解这些细胞的奥秘，研究人员进一步聚焦于 Tcf7 过表达的前体簇 1、2和耗竭簇3（图2A）。通过差异表达分析发现簇2相较于簇1有多达1482个基因上调，这一惊人的数字背后隐藏着无数的秘密。在簇2中检测到的 Tox、Lag3、Pdcd1、Ikzf2、Tnfrsf9 和 Myb 等基因，成为了研究人员揭开其神秘面纱的关键线索。基于这些重要发现，研究团队果断地将簇2命名为耗竭T细胞前体（Tpex），而簇1因其上调的151个基因与传统记忆标记紧密相关，被赋予了记忆前体T细（Tmpc）的称号（图2B）。基因集富集分析（GSEA）则像是一把精准的手术刀，进一步揭示了簇2富含耗竭基因特征，而簇1则呈现出急性感染基因特征（图 2E）。通过伪时序分析这一创新的技术手段，仿佛穿越时空，观察到Tpex和Tmpc存在着共同的前体，并且在感染后 3.25 天至 4.5 天期间，Tpex和Tmpc群体逐渐分化，清晰地呈现在人们眼前。这一系列深入的分析，有力地揭示了急性感染早期的前体细胞群并非单一，而是包含了经典记忆前体细胞以及类似慢性感染中Tpex的亚群，这一发现彻底打破了以往的认知局限。
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研究人员继续深入探索，决心用更多的证据来证实Tpex的存在。于是，他们巧妙地运用了流式细胞术这一强大的技术武器。将P14或 OT-1TCR 转基因T细胞转移到CD45.1同基因宿主小鼠体内，随后让这些小鼠分别感染急性LCMVArmstrong 菌株或表达卵清蛋白的重组水泡性口炎病毒（VSV-N4Ova）。在感染后 5 天或7天，研究人员精准地重新分离转基因T细胞，并运用流式细胞术进行细致分析。他们首先排除了Klrg1阳性的终末分化细胞，这些细胞就像是战场上的残兵败将，不再具有研究价值。然后，从剩余的细胞中筛选出PD-1表达最高或最低的群体，如同在众多士兵中挑选出最具潜力的精英。他们以总内源性CD8 T细胞为参考标准，首先筛选出 CD44hi 细胞，然后排除Klrg1阳性细胞，经过这一系列严格的筛选，清晰的 TCF1 群体得以呈现，并且在 TOX 表达上展现出显著的差异。同时，内源性CD44-CD62L + 幼稚细胞则像是一个稳定的参照系，作为TOX表达的内部阴性对照，确保了实验结果的准确性。
当把这套精心设计的门控策略应用到P14和 OT- 1T细胞时，令人惊喜的结果出现了。PD-1hi 和 PD-1lo 细胞在 TOX 表达水平上呈现出明显的差异，PD-1hi 组的 TOX 表达水平显著高于 PD-1lo 组（图 3A）。更为重要的是，这两种细胞群体中都包含着一定数量的 TCF1 + 前体细胞，其中 PD-1hi 细胞中的 TCF1 + 前体细胞表达 TOX，而 PD-1lo 细胞中的则不表达，这一发现就像是找到了打开Tpex存在之门的钥匙，有力地证明了通过流式细胞术能够成功检测到具有耗竭迹象和祖细胞标记的细胞。此外，研究人员还对两种前体细胞的差异进行了深入研究。他们发现 PD-1hi 前体细胞具有更为强烈的耗竭特征，就像是在战斗中疲惫不堪的士兵。这些细胞转录的耗竭相关受体（Pdcd1、Havcr2、Tnfrsf9）及其他耗竭相关基因（Tox、Tox2、Ikzf2）水平显著升高，而效应细胞因子（Ifng 和 Tnf）及 Id2 的转录水平则相对较低。为了进一步验证这一结果，研究人员在蛋白水平上进行了实验。他们在感染后 4.5 天分离出总脾细胞，并使用LCMV衍生的 gp33 和 np396 肽进行短暂的体外再刺激。实验结果再次证实，Tpex-like 细胞在产生 TNF 和 IFNγ 的能力上明显受损，（图 3F）。综合以上一系列严谨的实验结果，可以确凿地得出结论：在急性感染早期，确实会形成类似慢性感染相关的Tpex前体细胞，而且早期感染就像一个充满创造力的工厂，会产生多种不同类型的前体细胞，这一过程与感染最终是否会慢性化或被清除并无直接关联，这一发现无疑为T细胞耗竭的研究开辟了新的天地。
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在免疫研究的领域中，表观遗传一直被视为调控基因表达的关键因素，在T细胞耗竭的过程中也扮演着不可或缺的重要角色。为了深入探究急性感染中Tpex的表观遗传特征，研究团队充分利用了公共数据GSE164978，展开了一场深入的表观遗传探索之旅。在这个研究中，C57BL/6J小鼠被分别感染LCMVArmstrong 或LCMVclone-13，7 天后，研究人员从脾脏中分离出总CD8 T细胞，并运用单细胞分辨率的ATAC-seq 分析，试图揭开这些细胞表观遗传的神秘面纱。
研究人员首先对两种感染类型的细胞进行了联合聚类分析，这一过程就像是将不同来源的士兵按照特征进行分类。然后，他们巧妙地叠加参考bulk-signatures，对聚类后的单细胞分辨率ATAC-seq分析结果进行深入解读。naive 和Tmpc signature信号强度高的细胞之间存在着明显的重叠，这表明它们在表观遗传和转录机制上有着紧密的联系，就像是有着共同血脉的家族成员（图4B）。同样地，Tpex signature最强的细胞在Tmpc signature中也有着较高的得分，这进一步反映出它们部分共享的表观遗传图谱，仿佛在诉说着它们之间的渊源。基于这些重要的发现，研究人员果断地将细胞簇分别标记为naive细胞、Tmpc、Tpex、Teff和Tex（图4C）。在研究的最后阶段，他们对Tpex和Tmpc簇进行了差异可及性分析，并根据基因注释对差异可及区域进行了汇总。正如预期的那样，研究人员发现Tpex在 Tox、Tox2 和Pdcd1附近的多个区域具有更高的可及性，这就像是在这些区域打开了更多的通道，使得基因表达更容易受到调控（图4D）。
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更为有趣的是，研究人员观察到Tpex簇中同时包含了来自急性和慢性感染的细胞，这一发现就像是在连接急性感染和慢性感染的桥梁上找到了关键的基石，表明Tpex在不同感染阶段可能具有相似的表观遗传基础。通过直接比较 Armstrong 和 clone13 感染在Pdcd1基因区域的可及性，研究人员发现两者之间没有显著差异，这进一步有力地证明了急性和慢性感染的Tpex细胞在表观遗传上具有高度的相似性。为了更深入地探究这一现象，研究人员选择了仅感染LCMVArmstrong 的细胞，并绘制了Pdcd1位点的覆盖图，按照簇的分配进行了细致的划分。在灰色区域标注的是基于Tpex和Tmpc簇差异可及性确定的区域，通过这个图我们可以明显地观察到Tex和Tpex之间具有相似的可及性，而Tpex和Tmpc之间则存在着明显的差异，这一结果表明即使仅在急性感染来源的细胞中，Tpex和Tmpc的差异依然清晰可辨（图4E）。
研究人员继续深入挖掘，利用来自Armstrong感染的细胞子集，并整合已知转录因子结合基序的数据，试图找出驱动Tpex和Tmpc差异的潜在调控因子。在Tpex中 FOS::JUN 位点周围的区域具有更高的可及性（图 4G），这暗示着这些区域可能具有更高的转录因子活性，就像是在这些区域点燃了基因表达的引擎（图 4H）。综合以上全面而深入的分析，我们可以清晰地得出结论：在急性感染早期的Tpex细胞中，存在着与慢性感染Tpex相关的典型表观遗传标记，这一发现为我们理解T细胞耗竭的表观遗传调控机制提供了重要的线索，也为未来的研究指明了方向。
在T细胞耗竭的复杂研究领域中，配体亲和力和抑制信号对T细胞的激活起着至关重要的作用。为了深入探究它们在急性感染中对Tpex激活的影响，研究人员精心设计了一系列巧妙的实验。他们利用之前建立的一套成熟的实验系统，在这个系统中，OT1 T细胞在感染表达不同亲和力配体的重组水泡性口炎病毒时，会面临不同的刺激条件。具体来说，OT1 T细胞会分别接触其天然配体 SIINFEKL（N4，高亲和力）或低亲和力改变的肽配体 SIIVFEKL（V4），一场关于配体亲和力的较量就此展开。
实验结果令人瞩目，感染高亲和力VSV-N4的小鼠在7天后，TOX + 前体和效应细胞的频率发生了显著的变化，出现了大幅增加的现象，就像是在战场上被激发了强大战斗力的士兵；而感染 VSV-V4 的小鼠中，无论是前体还是效应细胞，几乎都没有 TOX + 表达，仿佛这些细胞在低亲和力的刺激下陷入了沉睡（图 5A-B）。这一鲜明的对比有力地表明，急性感染中Tpex的形成高度依赖于强TCR信号，就像是植物的生长离不开阳光和水分，强TCR信号是Tpex形成的关键因素。
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同时，鉴于PD-1是Tpex的关键特征之一，并且作为一种抑制性受体，它在T细胞激活过程中的作用一直备受关注。研究人员基于已有的知识和前期的研究结果，合理地假设PD-1表达可能会对Tpex的形成起到限制作用。为了验证这一假设，他们展开了一场严谨的实验。将野生型（WT）或PD-1敲除（KO）的P14转基因 CD8（CD45.1）T细胞转移到B6宿主（CD45.2）体内，然后让这些小鼠感染LCMVArmstrong，一场关于PD-1作用的探究正式启动。在感染7天后，研究人员通过流式细胞术对样本进行了细致的分析。
实验结果再次证实了研究人员的假设，PD-1敲除细胞在TCF1 + 前体和 TCF1-效应细胞群中，总TOX + 细胞的频率显著高于 WTP14 细胞，就像是解开了束缚的骏马，变得更加活跃。而且，前体细胞群的组成也发生了明显的变化，从 WT细胞中以 TOX-前体为主转变为PD-1KO P14T细胞中 TOX + 前体比例更高（图 5C-D）。这一结果充分表明，在急性感染中，强TCR信号就像一把推动Tpex形成的有力武器，而PD-1信号则像是一道限制的关卡，起到了限制Tpex生成的作用。单细胞转录组数据也进一步证实，高度激活的细胞呈现更强的耗竭信号，表明激活强度与耗竭特征的获得呈正相关（图5E-F）。综上所述，在急性感染早期，强烈的TCR信号促进 Tpex 形成，而PD-1表达则限制其生成。
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