大家好，今天为大家介绍的是最近在Journal of the American Chemical Society上报道的一篇标题为 “ClickRNA-PROTAC for Tumor-Selective Protein Degradation and Targeted Cancer Therapy” 的文章。该文的通讯作者是清华大学化学系的李景虹院士。本文开发了一种基于Click反应的预靶向PROTAC策略，能够使降解复合物特异性地在癌细胞中形成，从而实现不依赖细胞自身E3连接酶的选择性目标蛋白降解。
蛋白质水解靶向嵌合体（Proteolysis targeting chimera, PROTAC）能够利用细胞自身的泛素-蛋白酶体系统，快速降解目标蛋白，是一种新型的治疗手段。作为双功能小分子嵌合体，PROTAC由目标蛋白的配体和E3连接酶的配体构成，引起E3连接酶和目标蛋白的相互作用，实现目标蛋白的多泛素化和降解。PROTAC被认为有希望针对一些传统意义上“不可成药”的靶点，目前已经有多款药物在临床开发阶段，推进最为迅速的是Arvinas公司的雄激素/雌激素受体降解剂ARV-110和ARV-771，目前已经在临床III期试验阶段。然而，目前较为成熟的PROTAC均以VHL或CRBN作为E3连接酶降解目标蛋白，这两种连接酶在不同肿瘤细胞内的分布有差异，而且肿瘤特异性也较低，这限制了一些PROTAC在一些癌症治疗中的进一步应用，也容易造成脱靶毒性。
肿瘤细胞中的某些mRNA能够作为细胞类型特异性标志物实现翻译过程的调节。如肿瘤中的RNA腺苷脱氨酶ADAR能以细胞特异性的方式诱导终止密码子UAG的A-to-I碱基编辑，从而激活下游蛋白的翻译。然而目前尚未有将这类方法应用于肿瘤靶向的mRNA治疗过程中。
因此，在本文中，作者团队巧妙地利用了肿瘤细胞中这一翻译调控策略，开发了具有肿瘤细胞特异性降解能力的ClickRNA-PROTAC。该系统由三部分组成：一是携带叠氮基团弹头的目标蛋白配体；二是苄基鸟嘌呤（BG）-DBCO连接子；三是一段mRNA，其中5’端携带肿瘤细胞响应基序，与肿瘤细胞中的特异性mRNA互补配对，3’端编码一种E3连接酶-SNAP tag的融合蛋白，其中SNAP tag能够识别BG并与其共价偶联。
通过脂质载体转染mRNA后，与肿瘤细胞特异性mRNA发生互补配对，产生其中一段ACC-UAG错配，触发ADAR介导的碱基编辑，将UAG终止密码子变为UIG，激活3’端基因的编码，表达E3连接酶-SNAP tag蛋白。随后，SNAP tag识别BG-DBCO连接子，形成共价偶联产物，DBCO与叠氮发生Click反应，形成目标蛋白和E3连接酶的复合物，最终诱导目标蛋白的多泛素化和降解。由于在正常细胞中缺乏特异性互补mRNA，这个过程将无法发生。（图1）
图1. ClickRNA-PROTAC系统的设计组件和作用机制。 首先，作者筛选了不同的E3连接酶-共价连接tag的组合，选择了13种不同家族E3连接酶和2种不同的标签即Halotag和SNAP tag，构建了共52种mRNA。在HEK293FT细胞中挑选了16种表达量较高的E3连接酶-tag融合蛋白，并以BRD4作为降解靶标验证了降解效率。选择了降解效果最佳的SIAH1-SN作为后续研究的mRNA，并通过优化目标蛋白与叠氮弹头间的连接子长度实现了最佳降解效率，命名为JQ1-N3-C10。（图2，图3）
图2. 不同E3连接酶-tag融合蛋白的构建和降解效果筛选。图3. 不同长度的目标蛋白配体-叠氮靶头之间的连接子筛选。 随后，作者详细研究了ClickRNA-PROTAC系统的降解特性。降解靶头JQ1-N3-C10具有良好的细胞相容性，但添加SIAH1-SN mRNA后，其表现出JQ1-N3-C10浓度依赖的细胞活性和降解效率，IC50约为300 nM，DC50约为77.2 nM。他们还通过更换降解靶头的配体类型，成功靶向降解了KRAS和NF-κB两种在癌症治疗中具有重要意义的激酶或转录因子。通过Western Blot和定量蛋白质组学分析的方法验证了降解的可行性，证明了ClickRNA-PROTAC系统的泛用性。（图4）图4. ClickRNA-PROTAC的BRD4靶向蛋白降解效果分析和靶点泛用性拓展。 接下来，作者团队针对肾上腺皮质癌ACC系统进行了详细研究。他们首先构建了一套双荧光基因报告系统，用于筛选在ACC和正常肾上腺皮质细胞HACC上具有特异性的mRNA响应序列。将mCherry连接在5’端，NanoLuc荧光素酶融合在3’端，通过分析在ACC和HACC细胞中两者荧光信号的比值判断最佳的mRNA响应序列。最终通过筛选得到了IGF2-4具有最高的选择性，能够特异性地诱导mRNA在癌细胞SW-13中的翻译，而不会在正常细胞HACC中诱导翻译。利用这一序列构建的ClickRNA-PROTAC，SW-13细胞中的BRD4蛋白被高效降解，而正常细胞则不受影响。（图5）图5. 靶向肾上腺皮质癌的ClickRNA-PROTAC系统的构建和响应mRNA筛选。 最后，作者团队进行了动物实验，在小鼠模型上评估了ClickRNA-PROTAC的肿瘤治疗效果。在ACC异种移植模型中，ClickRNA-PROTAC系统展现出了比小分子PROTAC更优秀的肿瘤抑制效率，肿瘤组织中也观察到了BRD4的降解和Caspase-3的切割，证明了ClickRNA-PROTAC能够诱导基于BRD4降解的细胞凋亡，产生抑瘤效果。并且不会对正常组织器官产生毒性和副作用。（图6）图6. ClickRNA-PROTAC能够在动物模型上治疗肾上腺皮质癌且不带来副作用。 综上所述，作者团队开发了一种基于肿瘤细胞特异性mRNA响应的ClickRNA-PROTAC系统，能够克服传统PROTAC使用的E3连接酶的非特异性分布问题，实现不依赖肿瘤自身E3连接酶类型的选择性目标蛋白降解。他们通过广泛的筛选获得了具有最佳效率的降解靶头结构，在BRD4、KRAS、NF-κB等几个靶标上成功实现了降解，并在肾上腺皮质癌模型中产生了良好的治疗效果。有希望作为一种特异性蛋白降解平台被广泛使用。DOI: 10.1021/jacs.4c06402Link: https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.4c06402
