J. Am. Chem. Soc. | ClickRNA-PROTAC用于肿瘤选择性蛋白降解和靶向癌症治疗

吕华课题组 · 公众号 · · 2024-10-10 15:00

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大家好，今天为大家介绍的是最近在 J ournal of the A merican C hemical S ociety 上报道的一篇标题为 “ ClickRNA-PROTAC for Tumor-Selective Protein Degradation and Targeted Cancer Therapy ” 的文章。该文的通讯作者是清华大学化学系的李景虹院士。本文开发了一种基于 Click 反应的预靶向 P ROTAC 策略，能够使降解复合物特异性地在癌细胞中形成，从而实现不依赖细胞自身 E 3 连接酶的选择性目标蛋白降解。

蛋白质水解靶向嵌合体（ Proteolysis targeting chimera , PROTAC ）能够利用细胞自身的泛素 - 蛋白酶体系统，快速降解目标蛋白，是一种新型的治疗手段。作为双功能小分子嵌合体， P ROTAC 由目标蛋白的配体和 E 3 连接酶的配体构成，引起 E 3 连接酶和目标蛋白的相互作用，实现目标蛋白的多泛素化和降解。 P ROTAC 被认为有希望针对一些传统意义上“不可成药”的靶点，目前已经有多款药物在临床开发阶段，推进最为迅速的是 Arvinas 公司的雄激素 / 雌激素受体降解剂 A RV-110 和 A RV-771 ，目前已经在临床 I II 期试验阶段。然而，目前较为成熟的 P ROTAC 均以 V HL 或 C RBN 作为 E 3 连接酶降解目标蛋白，这两种连接酶在不同肿瘤细胞内的分布有差异，而且肿瘤特异性也较低，这限制了一些 P ROTAC 在一些癌症治疗中的进一步应用，也容易造成脱靶毒性。

肿瘤细胞中的某些 m RNA 能够作为细胞类型特异性标志物实现翻译过程的调节。如肿瘤中的 R NA 腺苷脱氨酶 A DAR 能以细胞特异性的方式诱导终止密码子 UAG 的 A - to - I 碱基编辑，从而激活下游蛋白的翻译。然而目前尚未有将这类方法应用于肿瘤靶向的 m RNA 治疗过程中。

因此，在本文中，作者团队巧妙地利用了肿瘤细胞中这一翻译调控策略，开发了具有肿瘤细胞特异性降解能力的 Click RNA-PROTAC 。该系统由三部分组成：一是携带叠氮基团弹头的目标蛋白配体；二是苄基鸟嘌呤（ B G ） - DBCO 连接子；三是一段 m RNA ，其中 5 ’ 端携带肿瘤细胞响应基序，与肿瘤细胞中的特异性 m RNA 互补配对， 3 ’ 端编码一种 E 3 连接酶 - SNAP tag 的融合蛋白，其中 S NAP tag 能够识别 B G 并与其共价偶联。

通过脂质载体转染 m RNA 后，与肿瘤细胞特异性 m RNA 发生互补配对，产生其中一段 A CC-UAG 错配，触发 A DAR 介导的碱基编辑，将 U AG 终止密码子变为 U IG ，激活 3 ’ 端基因的编码，表达 E 3 连接酶 - SNAP tag 蛋白。随后， S NAP tag 识别 B G-DBCO 连接子，形成共价偶联产物， D BCO 与叠氮发生 Click 反应，形成目标蛋白和 E 3 连接酶的复合物，最终诱导目标蛋白的多泛素化和降解。由于在正常细胞中缺乏特异性互补 m RNA ，这个过程将无法发生。（图 1 ）

图 1. Click RNA-PROTAC 系统的设计组件和作用机制。

首先，作者筛选了不同的 E 3 连接酶 - 共价连接 tag 的组合，选择了 1 3 种不同家族 E 3 连接酶和 2 种不同的标签即 Halotag 和 S NAP tag ，构建了共 5 2 种 m RNA 。在 H EK293FT 细胞中挑选了 1 6 种表达量较高的 E 3 连接酶 -tag 融合蛋白，并以 B RD4 作为降解靶标验证了降解效率。选择了降解效果最佳的 S IAH1-SN 作为后续研究的 m RNA ，并通过优化目标蛋白与叠氮弹头间的连接子长度实现了最佳降解效率，命名为 J Q1-N3-C10 。（图 2 ，图 3 ）

图 2. 不同 E 3 连接酶 -tag 融合蛋白的构建和降解效果筛选。

图 3. 不同长度的目标蛋白配体 - 叠氮靶头之间的连接子筛选。

随后，作者详细研究了 Click RNA-PROTAC 系统的降解特性。降解靶头 J Q1-N3-C10 具有良好的细胞相容性，但添加 S IAH1-SN m RNA 后，其表现出 J Q1-N3-C10 浓度依赖的细胞活性和降解效率， I C ₅₀ 约为 3 00 n M ， D C ₅₀ 约为 7 7.2 n M 。他们还通过更换降解靶头的配体类型，成功靶向降解了 K RAS 和 N F-κB 两种在癌症治疗中具有重要意义的激酶或转录因子。通过 Western B lot 和定量蛋白质组学分析的方法验证了降解的可行性，证明了 Click RNA-PROTAC 系统的泛用性。（图 4 ）

图 4. ClickRNA-PROTAC 的 B RD4 靶向蛋白降解效果分析和靶点泛用性拓展。

接下来，作者团队针对肾上腺皮质癌 A CC 系统进行了详细研究。他们首先构建了一套双荧光基因报告系统，用于筛选在 A CC 和正常肾上腺皮质细胞 H ACC 上具有特异性的 m RNA 响应序列。将 m C herry 连接在 5’ 端， N ano L uc 荧光素酶融合在 3’ 端，通过分析在 A CC 和 H ACC 细胞中两者荧光信号的比值判断最佳的 m RNA 响应序列。最终通过筛选得到了 I GF2-4 具有最高的选择性，能够特异性地诱导 mRNA 在癌细胞 SW-13 中的翻译，而不会在正常细胞 HACC 中诱导翻译。利用这一序列构建的 Click RNA-PROTAC ， S W-13 细胞中的 B RD4 蛋白被高效降解，而正常细胞则不受影响。（图 5 ）

图 5. 靶向肾上腺皮质癌的 ClickRNA-PROTAC 系统的构建和响应 m RNA 筛选。

最后，作者团队进行了动物实验，在小鼠模型上评估了 Click RNA-PROTAC 的肿瘤治疗效果。在 A CC 异种移植模型中， Click RNA-PROTAC 系统展现出了比小分子 P ROTAC 更优秀的肿瘤抑制效率，肿瘤组织中也观察到了 B RD4 的降解和 Caspase -3 的切割，证明了 Click RNA-PROTAC 能够诱导基于 B RD4 降解的细胞凋亡，产生抑瘤效果。并且不会对正常组织器官产生毒性和副作用。（图 6 ）

图 6. ClickRNA-PROTAC 能够在动物模型上治疗肾上腺皮质癌且不带来副作用。

综上所述，作者团队开发了一种基于肿瘤细胞特异性 m RNA 响应的 Click RNA-PROTAC 系统，能够克服传统 P ROTAC 使用的 E 3 连接酶的非特异性分布问题，实现不依赖肿瘤自身 E 3 连接酶类型的选择性目标蛋白降解。他们通过广泛的筛选获得了具有最佳效率的降解靶头结构，在 B RD4 、 K RAS 、 NF-κB 等几个靶标上成功实现了降解，并在肾上腺皮质癌模型中产生了良好的治疗效果。有希望作为一种特异性蛋白降解平台被广泛使用。

作者： DYH 审校： SYM

DOI: 10.1021/jacs.4c06402

Link: https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.4c06402