摘要：流感病毒每年继续导致数百万严重疾病和数十万人死亡。疫苗被用来预防流感爆发，然而，流感病毒会变异，需要每年接种疫苗以获得最佳保护。疫苗的有效性也受到其他潜在因素的影响，如人类免疫系统、与选定候选病毒的不匹配，以及与基于鸡蛋的疫苗生产相关的鸡蛋适应性。本文回顾了流感疫苗的开发过程，并描述了自2017季节以来，世界卫生组织对细胞培养过程和疫苗株建议的变更所带来的影响。传统流感疫苗的制造过程依赖于受精鸡蛋，这些鸡蛋用于疫苗生产。疫苗必须大量生产，基于鸡蛋的整个过程大约需要6个月。此外，当病毒适应鸡蛋内发现的禽类受体以在鸡蛋中生长时，会发生种子病毒的鸡蛋适应性。这些关键病毒抗原的变化可能导致抗原不匹配，从而降低疫苗的有效性。相比之下，细胞来源的种子病毒不需要受精鸡蛋，并消除了鸡蛋适应变化的可能性。因此，细胞培养技术提高了疫苗病毒株与选定疫苗株之间的匹配度，并已与在主要为H3N2季节期间增加的疫苗有效性相关联。在2017-2018流感季节期间，美国进行的一些小型研究比较了基于鸡蛋和细胞培养疫苗的有效性，并在此处进行了描述。这些观察性和回顾性研究表明，灭活细胞培养疫苗比基于鸡蛋的疫苗更有效。采用细胞培养技术进行流感疫苗制造已被报道可以提高制造效率，并且提高疫苗有效性的额外好处是未来政策制定考虑的关键因素。
1.引言
流感每年在全球导致多达500万例严重疾病和29万至65万例呼吸道死亡。它的出现与急诊室和初级保健医生访问次数的增加、工作和学校的缺勤率增加以及住院率的增加有关——特别是在老年人和有慢性疾病的人中。流感疫苗被广泛用于预防爆发。然而，病毒的关键病毒抗原发生抗原漂移（由于突变）以及即使接种疫苗也无法获得持久的抗体滴度，这意味着只有通过仔细的监测和预测新出现的菌株，才能通过每年接种疫苗来实现最佳保护。尽管有一个完善的监测和疫苗生产系统，但目前的流感疫苗，即使每年接种，也无法提供完全的保护。这有几个原因，包括人类免疫系统的特征、循环菌株和疫苗株之间的不匹配，以及病毒种子的鸡蛋适应性。采用细胞培养等新兴的制造技术分离种子病毒可能会提高疫苗病毒与循环菌株的匹配度，从而提高有效性，并进一步减少流感带来的疾病负担。在大流行的情况下，它还提供了一个更快反应的机会，这消除了对鸡蛋进行疫苗大规模生产的依赖。
2.背景
流感是一种传染性呼吸系统疾病，有三种不同的属或类型，A、B和C，它们在抗原上是不同的。流感A型进一步根据表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶分为亚型，如A/H1N1和A/H3N2。流感B型根据血统如B/Yamagata和B/Victoria进行区分（图1）。
图1. 流感病毒的解剖结构
流感A是流感在人类中最常见的原因之一。A/H3N2株有最高的发病率和死亡率。对美国31个流感季节的一项分析表明，在22个流感A/H3N2为优势株的季节中，死亡率是其他季节的2.7倍。其他地区也看到了类似的结果。在2014-2015年的英格兰冬季，28,484人死亡是由于流感，其中93%发生在65岁或以上的人中。在2017年澳大利亚的流感季节，当H3N2估计占55%的病例时，有745人死亡，与5年平均值176人相比。大多数死亡发生在老年人中。在2017-2018年美国的季节中，H3N2病毒占主导地位，有172名儿童死于流感，这是在单一非大流行季节报告的儿童流感相关死亡人数最多的一次。遗传上更稳定的流感B病毒，B/Yamagata和B/Victoria，已经流行了40年，但确定哪个将在一个季节中占主导地位仍然具有挑战性。流感C较少见，只引起轻度呼吸道感染。流感相关的并发症多种多样，包括肺炎、支气管炎、鼻窦感染、耳部感染以及许多慢性疾病如哮喘、充血性心力衰竭和慢性阻塞性肺疾病的加重。大多数感染流感的人会经历轻微的疾病，不需要医疗干预，并在2周内解决；然而，对其他人来说，流感并发症可能需要住院治疗，并可能导致死亡。在美国，对1976-2007年31个连续流感季节的分析表明，估计每年因肺炎和流感死亡的平均人数为6309人，最低为1986-1987年的961人，最高为2003-2004年的14715人。估计每年与流感相关的死亡人数，其潜在的呼吸和循环原因为23607人，最低为1986-1987年的3349人，最高为2003-2004年的48614人。大多数死亡（89.4%）发生在65岁或以上的人中。当观察到超额死亡率时，爆发被视为流行病。当新的流感病毒由于抗原转变而出现时，可能会发生大流行，死亡率可能会飙升。在1918年西班牙流感大流行中，全球有多达5000万人死亡；大流行也发生在1957年、1968年、1977年和2009年。尽管每次流感流行爆发的严重程度和受影响最多的群体各不相同，但已经确定了某些高风险群体，他们应该接受疫苗接种和治疗。在美国，建议每年对6个月及以上的每个人进行流感疫苗接种，使用任何获得许可的、适合年龄的流感疫苗。世界卫生组织（WHO）建议所有高风险群体（例如，任何怀孕阶段的孕妇、6个月至5岁的儿童、65岁以上的老年人、有慢性疾病的人和卫生保健工作者）接种流感疫苗。
3.流感疫苗生产技术
流感疫苗有不同形式：灭活流感疫苗（IIV）和减毒活流感疫苗（LAIV）。IIVs旨在针对三种（三价）或四种（四价）流感病毒提供保护；而LAIVs仅作为四价生产。IIVs可以通过不同的方式生产。IIVs可以由整个病毒经过化学灭活、浓缩然后纯化制成。进一步的处理可以制造分裂病毒疫苗，这些疫苗经过用清洁剂处理以分离病毒包膜并暴露内部病毒蛋白和亚病毒元素。进一步的纯化可以制造亚单位疫苗，其中富含HA蛋白。自20世纪70年代以来，由于它们的有效性相当且不良反应较少，大多数疫苗是分裂病毒或亚单位疫苗。分裂病毒和亚单位疫苗在未接触过流感疫苗的人群中的免疫原性较低；在季节性环境中，需要为幼儿接种两剂这些疫苗。为了提高特定人群（如老年人）的免疫原性，2010年批准使用一种三价疫苗的高剂量版本，其标准HA剂量是原来的四倍。佐剂——增加对抗原免疫反应的物质——可以添加到流感抗原中，以提高疫苗的免疫原性，特别是对于脆弱人群。一种含有MF59佐剂的流感疫苗，这是一种角鲨烯油-水乳液系统，已在美国、欧洲以及包括澳大利亚在内的亚太地区的一些国家获得许可，适用于65岁及以上没有对疫苗或其成分严重过敏反应史的人。在大流行流感疫苗中使用了多种佐剂，包括铝盐、MF59和AS03。其他佐剂正在研究中，包括免疫刺激DNA序列和细菌衍生成分。
流感病毒的一个关键特征是持续的抗原漂移，这要求疫苗因病毒通过抗原漂移而不断进化而每年重新配制（图2）。这种年度重新配制的需求是流感疫苗所独有的。
图2. 流感疫苗中的抗原漂移和抗原转变。抗原漂移发生在所有流感类型（A、B和C）中，是由抗体结合位点的血凝素、神经氨酸酶或两者的小突变引起的。抗原转变仅发生在流感A型中，是由血凝素或神经氨酸酶中整个基因片段的交换引起的（通常来自鸟类或猪），导致病毒新亚型的发展。抗原转变与大流行有关。
每年包含在疫苗中的候选疫苗病毒（CVVs）由WHO根据WHO全球流感监测和响应系统（GISRS）收集的信息进行选择。该系统与111个国家的141个国家流感中心合作，他们向WHO合作中心提供样本，以识别明年的流感病毒。一个相关的实验室网络每年测试大约100万个样本，并向WHO提供数千个流感病毒样本进行进一步评估。每年两次，分别在2月为北半球和8月为南半球举行疫苗咨询会议，以推荐疫苗株；以如此大的规模生产疫苗和最终的质量保证释放试验需要大约6个月，因此必须每年迅速做出疫苗成分选择。流感疫苗有良好的安全记录，但其有效性差异很大。一个重要问题是疫苗选定株和循环株之间潜在的不匹配，这并不罕见。2002年到2015年之间，发生了五次病毒与流感疫苗的不匹配。这些不匹配的潜在影响可以在那些年份看到的门诊访问增加中看到（图3）。
图3. 在选定的流感季节期间，流感样疾病的访问次数。
3.1.流感疫苗生产工艺
流感疫苗的种子病毒分离和生产过程也可能直接影响疫苗病毒与循环菌株的匹配度，从而影响流感疫苗的有效性（图4）。
图4. 传统的基于鸡蛋和新兴的基于细胞的流感疫苗生产工艺比较。CVV，候选疫苗病毒；MDCK，Madin-Darby犬肾。
70多年来，流感疫苗一直通过依赖鸡蛋的过程生产。用于生产的病毒要么直接从临床样本中获得，通过WHO GISRS直接在鸡蛋中传代成为CVV，要么如果病毒在鸡蛋中生长不好，它们将经历一个称为重组的过程，以获得生长更好的病毒。重组是通过将选定的潜在CVV与一个“供体”菌株共同感染鸡蛋进行的，供体菌株是一个在鸡蛋中生长良好的经过充分鉴定的病毒。当病毒在鸡蛋中生长时，它们可能交换基因片段，从而产生一个仍然包含所提出的CVV的重要抗原元素的病毒，但现在在鸡蛋中生长得更好，因为病毒含有来自供体病毒的基因。在更大的规模上，这种新的重组病毒被选为CVV，许多受精鸡蛋被病毒感染。经过一段孵化期后，从鸡蛋中收集羊水液，杀死（或灭活）病毒，纯化关键病毒抗原以用于流感疫苗。
传统的基于鸡蛋的过程是经过时间考验的过程，但可能存在一些挑战。对于灭活疫苗，每剂疫苗需要三到四个鸡蛋，这取决于它是TIV还是四价流感疫苗（QIV），这意味着必须协调生产超过1亿个受精鸡蛋，在必须无病原体（清洁）的鸡群中。确保清洁鸡群可能具有挑战性，同样在生产过程中保持无菌也是如此。卫生方面的失误可能导致需要拒绝大量的疫苗。此外，受精鸡蛋不是所有病毒株的理想基质；H3N2株生长不好。
重要的是，灭活流感疫苗的生产过程要求流感病毒感染过程中使用的细胞（例如鸡蛋中的禽类细胞）。季节性病毒在人类中生长，因此在一些哺乳动物细胞中自然生长。流感病毒需要结合细胞受体才能感染细胞。禽类细胞具有与哺乳动物细胞表面不同的受体。这意味着，人类流感病毒要在禽类细胞中生长良好，需要适应结合禽类受体，这一过程称为鸡蛋适应。不幸的是，流感病毒发生适应的区域与抗原上占主导地位的区域相同。这意味着，当病毒适应在鸡蛋中生长时，它有可能在抗原上与循环病毒不同。这种差异可能使基于鸡蛋的疫苗在预防流感感染方面的效果可能低于非鸡蛋适应的哺乳动物细胞生长的对应物。
2012年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了一种使用细胞培养技术生产流感疫苗的工艺。2016年，这一过程也扩展到包括分离和大规模生产，同样获得FDA批准，用于开发WHO分离的CVV（与基于鸡蛋的相对）。从2017-2018季节开始，WHO为基于鸡蛋和基于细胞的CVVs的季节性流感疫苗提供了菌株建议。
细胞培养技术过程在Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞中分离和生长病毒，而不是受精鸡蛋。基于细胞的流感疫苗的生产和细胞生长的CVVs允许消除鸡蛋适应变化的可能性，并生长更接近循环菌株的病毒。此外，基于细胞的生产不依赖于鸡蛋供应；相反，如果需要，MDCK细胞可以大量冷冻。基于细胞和重组流感疫苗在美国可供使用，最近，基于细胞的QIV也在欧盟获得了许可。正在进行努力使这些疫苗在更多地区可用。
细胞衍生病毒被证明比鸡蛋衍生病毒更好地匹配循环病毒。对2003年至2017-2018季节期间循环病毒与选定的MDCK衍生和鸡蛋衍生病毒的匹配度进行了分析，其中一些病毒被选为相应季节的疫苗。一项回顾性分析显示，与鸡蛋传播的病毒相比，MDCK传播的病毒与循环的流感A/H3N2病毒的匹配度要高得多。
其他新型生产流程正在开发中，以更快地生产有效的疫苗。在一种流程中，使用重组技术从“野生型”流感病毒中分离出HA基因，然后将HA基因插入基于杆状病毒的表达系统中。这种重组杆状病毒感染昆虫细胞，并表达杆状病毒蛋白和由插入基因编码的HA蛋白。收获并纯化表达的流感HA蛋白。结果产生的HA组分在遗传上与选定菌株的HA完全相同。这个过程可以在6-8周内生产一些疫苗量。
另一种正在开发的生产流程使用植物生产疫苗。这个过程与上述昆虫细胞流程类似，也使用一种病毒，该病毒编码所选HA的DNA序列。病毒感染宿主植物，并再次表达非流感病毒蛋白和选定的HA蛋白。与上述过程非常相似，从宿主细胞中纯化HA，这种纯化的HA作为疫苗的相关流感组分。生产流程可以在5-6周内生产疫苗。
4.鸡蛋衍生疫苗有效性的历史回顾
尽管流感疫苗被广泛推荐作为流感预防，但实际效果可能不是最佳的。这有几个原因：自然漂移、群体水平的免疫原性、研究方法、季节变化和菌株选择问题（包括鸡蛋适应）。对10项随机对照试验的荟萃分析发现，传统基于鸡蛋的三价灭活疫苗在12个季节（1967年至2011年）中针对所有流感菌株的汇总有效性为59% [95%置信区间（CI）：51-67]，在18-65岁的成人中。
对2004年至2015年鸡蛋基础流感疫苗有效性的更具测试阴性设计研究的更近期的荟萃分析包括56项研究。测试阴性研究招募了因急性呼吸道感染寻求医疗救治的患者，然后对他们的临床样本进行RT-PCR检测流感。那些测试阴性的人用作分析中的对照。荟萃分析显示，H1N1的疫苗有效性为67%（95% CI：29-85），H1N1pdm09为61%（95% CI：57-65），B型为54%（95% CI：46-61）。对于H3N2，总体汇总有效性要低得多，为33%（95% CI：26-39），与不匹配季节的更低有效性（23%）。这种H3N2疫苗有效性的降低在所有年龄组中都可以看到；儿童（43%），工作年龄成人（35%）和老年人（24%）。
5.2017-2018季节鸡蛋衍生和细胞衍生流感疫苗的比较有效性
基于细胞的灭活流感疫苗被证明比基于鸡蛋的灭活流感疫苗更有效。2017-2018年的实际观察研究评估了在受精鸡蛋中制备的灭活流感疫苗与在哺乳动物细胞中制备的灭活流感疫苗的相对有效性。该研究包括超过1300万65岁或以上医疗保险受益人——几乎所有这个年龄组中的美国疫苗接种者——他们接受了基于细胞的四价疫苗（n=659,249）或四种类型的基于鸡蛋的疫苗；四价（n=1,863,654），高剂量三价（n=8,489,159），佐剂三价（n=1,473,536），或标准剂量三价（n=1,018,494）。主要数据来源是医疗保险行政文件，患者详细信息包括从2017年8月6日到2018年8月4日的注册、住院和门诊护理、医生办公室访问和处方药。主要结果是流感相关的医院接触（即住院和急诊科访问，由国际疾病分类，第十版，临床修改代码定义的流感）。其他结果包括仅住院、流感相关的办公室访问和医院门诊访问。结果使用治疗权重的逆概率（IPTW）调整了协变量之间的不平衡。泊松回归用于评估预防流感相关医院接触。
在以H3N2为主导的流感季节中，经过IPTW调整的结果显示，对于流感相关的医院接触，基于细胞的四价疫苗比基于鸡蛋的四价疫苗[相对疫苗效力（RVE）11.0%，95% CI：7.9–14.0，p⩽0.05]、基于鸡蛋的标准剂量三价疫苗（RVE 10.8，95% CI 7.4–14.1，p⩽0.05）和基于鸡蛋的佐剂三价疫苗（RVE 7.5，95% CI 4.1–10.7，p⩽0.05）更有效，但与基于鸡蛋的高剂量三价疫苗相比没有显著性差异（RVE 2.3 95% CI：−0.8，至5.3，p⩽0.05）。对于仅流感相关的办公室访问，细胞培养的四价疫苗比基于鸡蛋的四价疫苗（RVE 5.7%，95% CI，1.9–9.4，p⩽0.05）、基于鸡蛋的佐剂三价疫苗（RVE 11.5%，95% CI，7.9–15.0，p⩽0.05）和基于鸡蛋的高剂量三价疫苗（RVE 5.1，95% CI 1.6–8.4，p⩽0.05）更有效，但与基于鸡蛋的标准剂量三价疫苗相比没有显著性差异（RVE 1.0%，95% −3.5至5.3）。
在2017-2018流感季节，美国一半的服役人员接种了基于细胞的疫苗。一项研究分析了2017年8月1日至2018年4月28日期间接受基于细胞的流感疫苗或基于鸡蛋的流感疫苗的国防医疗监测系统的数据分析。分析使用了两种研究设计。对于病例测试阴性设计，其中包括实验室确诊的流感病例，与基于鸡蛋的流感疫苗（n=3239）相比，基于细胞的流感疫苗（n=2467）的调整后的RVE为5%（95% CI：-10，17）。第二项研究设计基于按流感样疾病（ILI）或确诊流感的结果定义的队列。在所有队列中，50%接受了基于细胞的流感疫苗。与基于鸡蛋的流感疫苗相比，基于细胞的流感疫苗对ILI医疗接触的调整后的RVE为2%（95% CI：0，4），对ILI住院治疗为16%（95% CI：-9，35），对流感特定的医疗接触为16%（95% CI：11，20），对流感住院治疗为46%（95% CI：-18，76）。这些结果表明，基于细胞的流感疫苗的RVE与基于鸡蛋的流感疫苗相似或更高，但仅对ILI和流感特定的医疗接触具有统计学意义。其他结果没有统计学意义，因此应谨慎解释。
Kaiser Permanente Northern California的一项研究包括了2017-2018流感季节所有4岁至64岁的成员（n=3,015,891）。该研究评估了接受基于细胞的四价（n=84,440）或基于鸡蛋的（n=932,874），主要是三价（86.5%）的灭活流感疫苗的人。流感病例通过聚合酶链反应确认。与未接种疫苗的人相比，基于细胞的疫苗对流感A的有效性为30.2%（95% CI：17.1，41.3，p<0.0001），基于鸡蛋的疫苗为17.9%（95% CI：12.1，23.3）。与彼此相比，调整后的基于细胞的与基于鸡蛋的疫苗的RVE为6.8%（95% CI：17.1，41.3）。与未接种疫苗的受试者相比，基于细胞的疫苗的调整绝对疫苗有效性（VE）为30.2%（95% CI：17.1，41.3；p<0.0001），基于鸡蛋的疫苗为17.9%（95% CI：12.1，23.3；p<0.0001）。
与之前的研究类似，结果没有统计学意义，作者得出结论，增加的效力可能允许对基于细胞的疫苗是否确实比基于鸡蛋的疫苗有适度优势进行明确评估。
2017-2018流感季节的大型美国电子病历数据集被回顾性评估，以调查基于细胞的疫苗与基于鸡蛋的疫苗的有效性，针对前往初级保健实践的人。从2017年8月1日到2018年3月31日，4岁至65岁及以上的患者被纳入研究，接受了基于细胞的（n=92,192）或基于鸡蛋的（n=1,255,983）四价流感疫苗。整体RVE估计值，按预防流感样疾病（ILI）定义，对于基于细胞的四价灭活流感疫苗与基于鸡蛋的疫苗相比显著更高36.2%（95% CI：26.1，44.9，p<0.001）。
细胞培养制造系统仍然使用基于鸡蛋的CVVs以及基于细胞的CVVs，这是一个复杂因素；2017-2018年基于细胞的疫苗包括三个基于细胞的CVVs和一个基于鸡蛋的CVV（H1N1）。结果，鸡蛋-CVV病毒可能保留鸡蛋特征，而基于细胞的疫苗所显示的改进最有可能是由于基于细胞的组分，特别是对于H3N2。2019-2020年流感疫苗的所有四个组分首次都是基于细胞的CVV，这为我们提供了一个机会，在未来监测所有这些菌株的结果。
6.结论
季节性流感爆发和流行是我们现代世界的一个常态部分。流感疫苗在最小化可能是一种毁灭性疾病的影响方面非常重要。尽管疫苗已经可用多年，但依赖受精鸡蛋的传统制造过程在后勤上很复杂，基于鸡蛋的制造可能会由于需要连续和大量的鸡蛋供应而遇到延长的延误。此外，基于鸡蛋的疫苗通常受到种子菌株中鸡蛋适应的影响（特别是H3N2），这可能导致疫苗有效性降低。基于细胞的分离和制造新工艺提供了一些优势，包括改进的生产流程，可能允许更快的开发和最小化鸡蛋适应。研究表明，在基于细胞的过程中产生的病毒比在基于鸡蛋的过程中产生的病毒更接近循环病毒，而2017年至2018年季节的观察数据为潜在的提高有效性提供了一些支持证据。因此，用于生产流感疫苗的基于细胞和其他非鸡蛋技术可能会进一步减少疾病负担，因为研究人员继续寻找通用流感疫苗的圣杯。
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