2025 年 3 月 28 日，首都医科大学 的王玉记研究团队在 JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY 上发表了题为 Design, Synthesis, Evaluation, and SAR of 5-Phenylisoindoline Derivatives, a Potent Class of Small-Molecule Inhibitors Targeting the Programmed Cell Death-1/Programmed Cell Death-Ligand 1 (PD-1/PD-L1) Interaction 的文章。在这篇文章中， 研究团队 通过结构优化策略，从海洋微生物来源的异吲哚类生物碱启发，去除传统长链连接基团，构建了以异吲哚啉为核心骨架的紧凑分子结构，合成了一系列新型小分子 PD-1/PD-L1 抑制剂，其中化合物 D6 展现出卓越的体外活性 （ IC ₅₀ =4.8 nM ） 。

在体外实验中， D6 能够显著促进外周血单核细胞（ PBMCs ）分泌干扰素 -γ （ IFN-γ ），并且在 100 nM 的浓度下就能显著减少免疫细胞的晚期凋亡，从而恢复免疫细胞的活性。此外， D6 在多种正常细胞系中表现出低毒性，其 IC ₅₀ 值均超过 10μM ，进一步证明了其作为免疫调节剂而非细胞毒性分子的潜力。 在体内实验中， D6 在 MC38 小鼠肿瘤模型中表现出显著的抗肿瘤效果。通过腹腔注射（ 20 mg/kg ）， D6 实现了 52.8% 的肿瘤生长抑制，而口服给药（ 160 mg/kg ）则达到了 64.4% 的肿瘤生长抑制。在治疗期间，所有组的小鼠体重没有明显变化，且主要器官的 的重量比例也没有显著差异，表明 D6 具有良好的耐受性和安全性。

这些结果表明， D6 作为一种新型小分子 PD-1/PD-L1 抑制剂，不仅在体外展现出高活性和低毒性，而 且在体内也表现出显著的抗肿瘤效果和良好的安全性，具有进一步开发为临床治疗药物的 潜力。

PD-1/PD-L1 通路是肿瘤免疫逃逸的核心机制，其作用贯穿于癌症发生、发展及治疗抵抗的全过程。在正常生理状态下， PD-1 主要表达于活化的 T 细胞表面，通过与正常组织中低水平表达的 PD-L1 结合，抑制 T 细胞过度激活以维持免疫稳态。然而，肿瘤细胞通过致癌信号（如 EGFR 、 PI3K-AKT 通路激活）或微环境中炎性因子（如 IFN-γ 通过 JAK-STAT1 通路）驱动 PD-L1 的异常高表达，利用这一免疫检查点通路逃避免疫监视。当 PD-L1 与 T 细胞上的 PD-1 结合时，通过胞内 ITIM/ITSM 结构域招募 SHP-1/SHP-2 磷酸酶，抑制 TCR 和共刺激信号下游的 PI3K-AKT 、 RAS-MAPK 通路，导致 T 细胞增殖受阻、效应功能耗竭（如 Granzyme B 分泌减少）、代谢重编程（葡萄糖摄取受限）及凋亡增加，最终使肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答被 “ 关闭 ” 。此外， PD-1/PD-L1 信号还通过募集调节性 T 细胞（ Tregs ）、髓系来源抑制细胞（ MDSCs ）及促进免疫抑制因子（如 TGF-β 、 IL-10 ）分泌，协同抑制抗原呈递（如下调 MHC-I 分子）和细胞毒性 T 细胞活性，形成多维免疫抑制网络。

基于 PD-1/PD-L1 通路在肿瘤免疫逃逸中的关键作用，针对该通路的免疫检查点抑制剂（如 帕博利珠单抗、纳武利尤单抗等 ）已成为癌症免疫治疗的重要策略。这些药物通过阻断 PD-1/PD-L1 的相互作用，重新激活 T 细胞，恢复其抗肿瘤功能，从而实现肿瘤的持久缓解。然而，尽管 PD-1/PD-L1 阻断治疗 已在黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈部癌等多种实体瘤中展现出显著疗效，甚至实现部分患者的长期生存， 但其效率仍然较低，且存在个体差异和肿瘤异质性。

在本研究中， 研究团队从海洋微生物来源的异吲哚类生物碱中获得灵感，设计了一系列以异吲哚啉为核心骨架的小分子化合物。 并进行了全面的结构 - 活性关系优化，并最终确定了优化的化合物 D6 。

研究团队通过实验展示了化合物 D6 在 MC38 小鼠结肠癌模型中的抗肿瘤效果 。 实验通过测量肿瘤体积、肿瘤重量、小鼠体重、器官重量和器官指数等多个指标，全面评估了 D6 的疗效和安全性。结果显示， D6 在 20 mg/kg 剂量下显著抑制了肿瘤生长，肿瘤体积和重量均明显减少，肿瘤生长抑制率达到 52.8% 。同时， D6 的抗肿瘤效果呈剂量依赖性，表明其对 PD-1/PD-L1 通路的阻断作用具有明确的量效关系。在安全性方面， D6 对小鼠体重无显著影响，说明其对小鼠的整体健康状况无明显毒性。此外， D6 处理组的主要器官（心、肝、脾、肺、肾）重量和器官指数与对照组相比无显著差异，表明 D6 未对小鼠的主要器官造成明显损伤（图 2 ）。

为了更全面地评估 D6 的安全性，通过 H&E 染色进行的组织病理学分析也未发现 D6 处理组的肿瘤组织或正常组织存在明显的损伤或异常。实验还检测了小鼠血清中的 AST （天门冬氨酸氨基转移酶）、 ALT （丙氨酸氨基转移酶）和尿素水平，这些指标是评估肝肾功能的重要参数。结果显示， D6 处理组与对照组相比无显著差异，表明 D6 对小鼠的肝肾功能没有产生明显的不良影响。这些结果进一步证明了 D6 的安全性（图 3 ）。

上述结果说明， D6 是一种有效的 PD-1/PD-L1 通路抑制剂，能够在显著抑制肿瘤生长的同时保持良好的安全性。 D6 的抗肿瘤效果通过减少肿瘤体积和重量得到了验证，而其安全性则通过体重、器官重量、组织病理学分析和生化指标的评估得到了支持。这些结果为 D6 作为新型抗肿瘤药物的进一步开发提供了坚实的实验依据。

接下来，研究团队进一步展示了 化合物 D6 对肿瘤免疫微环境的影响，通过流式细胞术和免疫组织化学分析评估了 D6 对肿瘤组织中免疫细胞浸润和功能的影响（图 4 ）。实验在 MC38 小鼠模型中进行，流式细胞术结果显示， D6 处理组的肿瘤组织中 CD8 ⁺ /CD4 ⁺ T 细胞比例显著高于对照组，表明 D6 能够增强 CD8 ⁺ T 细胞的浸润， D6 处理组的肿瘤组织中 CD8 ⁺ T 细胞的浸润水平显著提高。此外，免疫组织化学分析进一步证实了这一结果，显示 D6 处理组的肿瘤组织中 Granzyme B （ Gzmb ）表达水平显著增加，表明 D6 能够增强 CD8 ⁺ T 细胞的活性，从而更有效地攻击肿瘤细胞。同时， Ki67 的表达水平在 D6 处理组中显著降低，表明 D6 能够抑制肿瘤细胞的增殖（图 4C ）。这些结果共同表明， D6 作为一种小分子 PD-1/PD-L1 抑制剂，不仅能够阻断免疫抑制通路，还能激活免疫系统，增强抗肿瘤免疫反应，为 D6 的进一步开发提供了重要的实验依据。

图 4. 化合物 D6 对肿瘤免疫微环境的影响

作者进一步研究了化合物 D6 对小鼠血清中四种关键细胞因子（ IFN-γ 、 IL-2 、 TNF-α 和 IL-6 ）水平的影响（图 5 ），这些细胞因子在免疫激活和抗肿瘤反应中发挥重要作用。实验在 MC38 小鼠模型中进行，结果显示， D6 处理组的血清中 IFN-γ 、 IL-2 、 TNF-α 和 IL-6 的水平均显著高于对照组，并且这种增加呈剂量依赖性。具体来说， D6 处理组的 IFN-γ 水平显著提高，表明 D6 能够增强 T 细胞的激活和功能； IL-2 水平的增加表明 D6 促进了 T 细胞的增殖和存活； TNF-α 水平的显著升高表明 D6 具有较强的免疫激活作用，能够直接杀伤肿瘤细胞并增强免疫反应； IL-6 水平的增加进一步支持了 D6 的免疫调节作用。与 BMS202 相比， D6 在相同剂量下表现出更强的免疫激活效果，表明其作为 PD-1/PD-L1 通路抑制剂的潜力。这些结果表明， D6 能够显著增强免疫相关细胞因子的水平，从而激活免疫系统，增强抗肿瘤免疫反应，为 D6 在免疫治疗中的应用提供了 重要的实 验支持。

接下来作者还探究了化合物 D6 在 MC38 小鼠结肠癌模型中的抗肿瘤效果，特别是通过口服给药途径的疗效评估（图 6 ）。实验 MC38 小鼠模型中进行，小鼠随机分为五组，分别接受不同剂量的 D6 （ 40 、 80 和 160 mg/kg ，口服给药）、抗 PD-L1 抗体（ 10 mg/kg ，腹腔注射）以及等体积缓冲液作为对照组。结果显示， D6 处理组的肿瘤体积增长显著减缓，尤其是在 160 mg/kg 剂量下，肿瘤生长抑制率达到 64.4% 。肿瘤重量的测量结果进一步支持了这一发现，表明 D6 能够显著抑制肿瘤的生长。与此同时， D6 对小鼠体重无显著影响，表明其对小鼠的整体健康状况没有产生明显的负面影响。此外， D6 处理组的主要器官（心、肝、脾、肺、肾）重量和器官指数与对照组相比无显著差异，表明 D6 未对小鼠的主要器官造成明显的损伤。这些结果表明， D6 通过口服给药也能够显著抑制肿瘤生长，且在高剂量下表现出更强的抗肿瘤效果，同时保持了良好的安全性和耐受性。这一发现支持 D6 作为一种潜在的口服 PD-1/PD-L1 通路抑制剂，用于癌症免疫治疗的进一步开发。

图 6. 化合物 D6 口服给药的抗肿瘤效果

综上所述，这篇文章详细报道了化合物 D6 的发现、合成、体外和体内活性研究，以及其作为新型口服 PD-1/PD-L1 抑制剂在肿瘤治疗中的潜力。 研究团队通过分子对接和计算方法，设计并合成了一系列 5- 苯基异吲哚啉衍生物，并对其进行了全面的活性评估。实验结果表明，这些化合物在体外和体内模型中均展现出良好的抑制活性和低毒性。特别是化合物 D6 ，其在体外实验中展现出了强大的活性， IC ₅₀ 值为 4.8 nM 。此外， D6 在 MC38 小鼠肿瘤模型中也显示出了剂量依赖性和低毒性，肿瘤生长抑制率分别达到了 52.8% （ 20 mg/kg ，腹腔注射）和 64.4% （ 160 mg/kg ，口服）。机制研究进一步揭示了 D6 能够激活肿瘤免疫微环境，增强 CD8 ⁺ T 细胞的浸润和活化，同时减少肿瘤细胞的增殖活性。这些发现表明， D6 是一个具有前景的小分子先导化合物，为 PD-1/PD-L1 阻断治疗提供了一个新的选择。研究团队还通过分子对接和高斯计算，深入探讨了 5- 苯基异吲哚啉骨架与 PD-L1 蛋白的相互作用模式，为未来的小分子药物设计提供了重要的结构信息。总体而言，这项研究不仅为 PD-1/PD-L1 通路的小分子抑制剂开发提供了新的思路，也为肿瘤免疫治疗领域带来了新的希望。

原文链接： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c02206

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