军事医学科学院卫生学环境医学研究所李君文、金敏等ISME：氯消毒通过自然转化促进细菌属间抗生素抗性基因的交换

WW's Lab

第一作者： Min Jin

通讯作者： Min Jin & Jun-wen Li

通讯单位： 军事医学科学院卫生学环境医学研究所环境与健康系环境与食品安全风险评估与控制重点实验室、昆士兰大学高级水管理中心 (AWMC)

摘要：饮用水氯消毒在预防和控制全球水传播疾病暴发中发挥着重要作用。然而，人们对氯化后细菌中抗生素耐药基因(ARGs)富集的原因知之甚少。在这里，研究了被杀死的耐药细菌(ARB)释放的ARGs和氯化过程中产生的可培养氯损伤细菌作为受体，以确定它们在消毒处理过程中对ARGs水平转移的贡献。我们发现，大肠杆菌、阿伯丁沙门氏菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌对次氯酸钠具有不同的抗性，并且可转移的RP4在被杀死的敏感供体中持续释放。同时，耐氯损伤细菌的存活和增强的细胞膜通透性及强烈的氧化应激反应表明，与未处理的细菌相比，RP4可以将生理活性的细胞转移，其转化频率提高了550倍。此外，化学需氧量(COD _Mn )、铵态氮和金属离子(Ca ²⁺ 和K ⁺ )等水质因子能显著促进上述释放的RP4向损伤粪肠杆菌转化的频率。我们的研究结果表明，氯化过程通过自然转化促进了质粒的水平转移，导致ARGs在细菌属之间的交换和新的ARB的出现，以及氯损伤的机会病原体从非ARB转移到ARB。考虑到这些转移元素对通过消毒降解具有相当的抵抗力，这种情况对公众健康构成了潜在的风险。

1 Introduction

抗生素耐药性已经成为世界性的危机。据估计，如果现在不采取行动，到2050年，抗生素耐药可能每年将造成1000万人伤亡。同时，随着水生生态系统中抗生素耐药基因(ARGs)和抗生素耐药菌(ARB)种类的不断增加，可能促进ARB全球传播的环境ARGs被列为新兴污染物。因此，帮助ARGs在环境中传播的方法正引起全球的关注。

氯消毒作为一种广泛使用的杀灭病原菌、保证饮用水微生物安全的手段，在防治水传播疾病暴发方面做出了重要贡献。理论上，它应该有助于减少甚至消除ARB和ARG。然而，报道的氯化后成品水中ARG水平的富集意味着消毒后的水中细胞内ARG (iARG)或细胞外ARG(eARG)的比例远高于消毒前的水。氯消毒丰富细菌中的ARG，促进ARB和ARG在水中的传播，这一发现对公共卫生构成潜在风险。有趣的是，氯消毒导致这种情况的原因以及在消毒过程中触发抗生素耐药传播的因素仍然不清楚。

自 然遗传转化是一个过程，在这个过程中，一个有能力的细菌受体接受裸露的DNA，并将其整合到自己的染色体中，或者将其转化为一个自主的染色体外复制子。作为传播ARG的重要途径，除了有能力的细菌受体外，还需要供体提供用于转移的ARG。考虑到在氯化过程中，大量具有生物活性的ARG载体会从被杀死的供体中释放出来，这将有助于增加消毒后的eARG，据推测，氯化过程可以通过促进释放的ARG的吸收和细菌间的遗传转化来提高iARG的丰度。此外，可培养的氯损伤细菌可能在这一过程中发挥作用。可培养的氯伤细菌是有活力但生理上不健康的种群，它们对氯具有耐受性。这些细菌可能占消毒后存在的所有指示细菌的90%。由于部分或不适当的消毒会造成可逆的损害，使用特定的选择性介质无法检测到它们，导致对它们存在的低估，并且只有在某些情况下才能恢复健康，从而对水安全构成危害。在此之前，我们发现可培养的受氯损伤的铜绿假单胞菌对抗生素具有暂时的生理持久性。然而，在消毒处理过程中，培养的氯伤细菌对遗传转化的贡献尚不清楚。

本研究将次氯酸钠(NaClO)暴露于携带RP4质粒的大肠杆菌、阿伯丁沙门氏菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌后，观察了从杀死的ARB(供体)中释放的RP4的可转移性及其对氯损伤细菌(受体)的遗传转化性。然后，我们进一步研究了物理化学参数，包括pH、温度、化学需氧(COD _Mn )、铵态氮(NH ₄ ⁺ –N)和金属离子(Ca ²⁺ 和K ⁺ )对从被杀死的细菌释放的质粒RP4自然转化为氯损伤的粪肠杆菌的频率的影响，这是生物膜相关的机会性感染的常见原因。我们首次发现，培养出的耐氯损伤的非抗生素耐药细菌是一种具有细胞膜通透性和强氧化应激反应的能力细胞，能够从敏感供体中吸收释放的RP4，并以较高的频率持续转化为ARB。这一信息将有助于理解氯化过程中ARG水平富集的原因，并揭示消毒过程中ARG在细菌之间的传播途径。

2 Materials and Methods

菌株和培养基

本研究中使用的菌株和质粒列表见附表S1。细菌的培养条件见附录文本1。

表S1 本研究中使用的菌株和质粒

消毒实验

微生物灭活实验在250 mL无菌玻璃瓶中进行，瓶内装100 mL菌悬液，终浓度为10 ⁵ –10 ⁶ cfu/mL。用于暴露于NaClO的细菌悬浮液的制备(Sigma-Aldrich，USA)见附录文本2。然后将NaClO添加到所有小瓶中(除了对照小瓶)，样品在摇床中以150 rpm的转速混合均匀。在不同时间点(即15 s,1 min,2 min,5 min,10 min,20 min和30 min)，NaClO与菌悬液接触前后各收集10 mL样品。所有经NaClO处理的样品立即用0.1 mol/L的硫代硫酸钠重新滴定，然后用N,N-二乙基-对苯二胺法分析余氯。每个实验在温控培养箱中进行，一式三份。NaClO消毒动力学建模的细节在附录文本3中给出。

损伤细菌的计数

根据之前的方法，测定处理后水样中可存活的损伤菌数。简单地说，将经过NaClO处理的适当稀释的细菌样本铺在TSYA和相应的选择培养基上，一式三份(附录文本1)。在37°C孵育过夜后，计算TSYA上的活菌数量和选择培养基上未损伤的细菌数量。确定差值为活菌损伤菌数量。

通过遗传转化检测可转移的RP4

如果样品能够通过热休克法成功转化具有化学活性的大肠杆菌DH5α并且能够进行功能转移，质粒RP4就被检测为阳性。根据附录文本4，在不同时间点消毒样品中释放的DNA被浓缩。然后，将10 μL浓缩的DNA样品加入到50 μL化学活性强的大肠杆菌DH5α (Takara, 中国大连)中，冷冻30 min，然后在42°C下热休克90 s。每个管中添加500 μL的SOC培养基，在37℃水浴中孵育1 h，将细胞悬液等分铺在含有50 mg/L卡那霉素(Kan)、60 mg/L氨苄西林(Amp)和40 mg/L四环素(Tet)的SOB培养基上，测定转化子数量。每个实验一式三次。

细胞通透性评估

统计分析测定了邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)在大肠杆菌中的水解率，以评估细胞通透性，并监测了420 nm处的吸光度值。每个实验一式三次。详情见附录文本5和6。

细菌活性氧(ROS)和抗氧化系统的测量

采用DCF-DA/H2DCFDA-cellularROS检测试剂盒(Abcam，英国)和流式细胞仪(BD FACS Calibur，美国)检测细菌ROS。细菌抗氧化系统，包括过氧化氢酶(CAT)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，采用南京建成生物工程研究所(中国南京)的商用试剂盒和微孔板读数仪(分子器件，美国)进行检测。所有检测均按照制造商的说明书进行，并一式三份。这些程序的细节请参阅附录文本5、7和8。

NaClO暴露诱导的自然转化试验

考虑到细菌之间存在接合转移，在相同条件下，将两种耐氯性不同的细菌分别暴露于NaClO中，然后将其混合，以证明NaClO暴露诱导的质粒转化。简单地说，将含有10 ⁹ cfu/mL 大肠杆菌、阿伯丁沙门菌和铜绿假单胞杆菌(携带RP4的供体)的水样用6 mg/L NaClO处理20 min，杀死大部分细胞(附表S2)，然后用0.1 mol/L硫代硫酸钠中和并过滤(0.22 μm过滤器，millipore，美国)，以去除全部残留细菌。同时，用6 mg/L NaClO制备6.3×10 ⁸ cfu/mL的无RP4氯损伤粪肠杆菌(受体)(附录文本5)，并将10 μL过滤后的溶液加入到100 μL氯损伤菌中，在37℃共培养60 min。将混合物涂布在含有50 mg/L卡那霉素、60 mg/L氨苄西林素和40 mg/L四环素的SOB培养基上。37℃孵育过夜后，计数菌落。每个实验一式三次。

此外，为了确保在SOB培养基上生长的细菌是变形菌，而不是受体的任何自发突变或供体的污染，将至少五个菌落散布在含有50 mg/L卡那霉素, 60 mg/L氨苄西林素和40 mg/L四环素的粪肠杆菌CATC培养基上。提取质粒，PCR检测RP4特异性TraG。PCR检测RP4的详细信息见附表S3。用转化子数除以活菌数计算转化频率。

统计分析

统计分析使用IBM SPSS统计软件(20.0版，Armonk,NY: IBM公司)进行。使用t检验分析各组的转化频率和氧化应激反应。采用单因素方差分析(ANOVA)比较氯损伤和不受氯损伤大肠杆菌的ONPG水解曲线的差异。在所有的检验中，只有P值<0.05的数据才被认为具有统计学意义。

3 Results

ARB在NaClO暴露过程中表现出不同程度的氯消毒抗性

为了观察ARB的杀灭动态，在pH为7.2、温度为20°C的缓冲消毒水中，进行了含有不同初始浓度次氯酸钠的台式尺度灭活实验。我们对大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、阿伯丁沙门菌和粪肠球菌(携带RP4)这四种抗生素耐药细菌在次氯酸钠处理期间的灭活动力学进行了研究。拟合的氯衰变曲线和细菌灭活动力学见附图S1-S3。不同初始NaClO浓度下的氯衰变常数k'，以及估计的效率因子hm(EFH)模型参数汇总在附表S4中。这些数据表明，EFH模型与所有观测到的ARB失活数据拟合良好，R ² 均在0.97以上。通过拟合NaClO对不同水平ARB失活的EFH模型，计算Ct值(附表S5)，即达到规定的目标生物减少所需的消毒剂浓度和接触时间的乘积。

观察到的ARB失活曲线(图1)基于拟合EFH模型计算的Ct值。TSYA和选择性培养基对氯损伤菌的检测均有相似的致死性，但选择性培养基对氯损伤菌的检测失败，致死率高于TSYA。例如，暴露8.4 mg/L min后，TSYA培养基的大肠杆菌杀灭率为4.0-log，而Endo培养基的杀灭率为4.5-log以上。重要的是，菌株对NaClO表现出不同的抗性能力，尽管粪肠球菌最强。用TSYA培养基检测，Ct值达到22.8 mg/L min，可完全杀灭4-log粪肠杆菌。另外，在观察到的细菌中，大肠杆菌对NaClO最敏感。完全杀死4-log大肠杆菌的Ct值仅为8.4 mg/L min。完全杀死各种细菌的Ct值之间的显著差异表明，即使完全杀死敏感的大肠杆菌，对氯具有较强抵抗力的细菌，如粪肠杆菌，也有可能在NaClO暴露下存活。

图1 选择培养基和TSYA培养基检测次氯酸钠(NaClO)时各种耐药细菌(ARB)的失活曲线。基线条件为：细菌初始浓度10 ⁵ –10 ⁶ cfu/mL (pH 7.2，20℃)。Nt/No：TSYA培养基或选择性培养基在给定时间检测到的活菌数/零时间细菌数。虚线表示通过估计的效率因子Hom (EFH)模型拟合Ct值。实线为观测Ct值(n=3；平均值±标准差)

暴露于NaClO后，被杀死的ARB可以向周围环境提供可转移的质粒

在NaClO处理过程中，被杀死的ARB逐渐向周围释放相应的RP4。为了测试ARB释放的RP4的可转移性，对不同剂量NaClO的ARB悬浮液进行过滤，去除ARB，然后与具有化学活性的大肠杆菌DH5α共培养。表1总结了在pH 7.2和20°C下ARB释放的RP4破坏的Ct值。结果表明，即使在Ct值为25.8 mg/L min的铜绿假单胞菌和39.8 mg/L min的粪肠杆菌消毒后仍能形成转化体，而用Cetrimide琼脂或CATC琼脂检测不到活的ARB(图1)。因此，可转移质粒可以从杀死的敏感ARB中释放出来。去除质粒所需的NaClO比杀死ARB所需的要多得多(比较表1和图1)。即使ARB被杀死，RP4作为存在于水中的ARB赠予的ARG载体是稳定的，并且保持可转移性。

表1 NaClO处理的ARB(10 ⁵ −10 ⁶ cfu/mL)释放的RP4在pH为7.2，20°C条件下转化为化学活性强的大肠杆菌DH5α的能力

NaClO暴露过程中产生的氯损伤细菌的生存表现出 具有增加的膜通透性和强烈的氧化应激反应的生理能力

与此同时，在NaClO暴露过程中不断发现氯损伤菌的产生。从图2可以看出，损损伤菌浓度在2 min暴露时间点达到峰值，其Ct值在2.0-4.2 mg/L min范围内，然后随着暴露剂量的增加，其浓度逐渐下降。当NaClO浓度分别为16.1、19.3、29.3和38.3 mg/L min时，损伤菌在活细胞中的比例急剧增加，残余的活大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阿伯丁链球菌和97%的活粪肠杆菌均发生损伤(低于100 cfu/mL)。因此，在氯化过程中，活菌逐渐受到伤害，最终对氯耐受性较强的存活种群受到伤害。

图2 NaClO作用下氯损伤菌产量曲线及其占总活菌的百分比(n=3；平均值±标准差)。基线条件为：细菌初始浓度10 ⁵ –10 ⁶ cfu/mL (pH 7.2，20℃)

为了测试氯损伤细菌是否具有生理活性，使用RP4来评估它们向氯损伤或经CaCl ₂ 制备的感受态的大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阿伯丁沙门菌和粪肠球菌的转化能力(图3，附录文本5)。数据表明，RP4能进入上述所有类型的损伤细菌并成功存活，其转化效率高于相应的经CaCl2制备的感受态细菌(p=1.87×10 ⁻⁴ ，1.01×10 ⁻⁴ ，6.61×10 ⁻³ ，1.88×10 ⁻³ )和未处理菌(p=1.0×10 ⁻⁴ ，8.8×10 ⁻⁵ ，3.3×10 ⁻³ ，1.5×10 ⁻³ )。综上所述，与相应的未处理菌相比，受氯损伤的粪肠杆菌将RP4的转化频率提高了550倍，达到9.8×10 ⁻⁵ ，而对经CaCl ₂ 制备的感受态菌的转化频率仅提高了21倍，为3.7×10 ^{− 6} 。

图3 氯损伤菌和CaCl ₂ 预处理的感受态细菌的RP4可转化性比较(n=3；平均值±标准差)。根据热休克试验，将RP4(100 ng)加入到100 µL的10 ⁸ cfu/mL氯化钙法制备的氯损伤菌或具有生理活力的细菌中。选择未暴露于NaClO的细菌(10 ⁸ cfu/mL)作为对照。*p < 0.01，与未处理菌比较；#p< 0.01，与CaCl ₂ 预处理的感受态细菌比较

结果显示，氯损伤大肠杆菌的ONPG水解率为10 ⁸ cfu/mL(图4)。与对照组(未处理的大肠杆菌)相比，损伤大肠杆菌的ONPG水解率显著提高了3.1倍(p = 0.0095)。结果表明，NaClO对氯损伤菌的细胞膜通透性有所提高。

图4 观察和拟合的ONPG水解曲线(n = 3；平均值±标准差)。在对照(未暴露大肠杆菌)和氯损伤大肠杆菌中，直线斜率(即ONPG水解率)分别为0.010和0.031

此外，我们还研究了氯损伤的大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阿伯丁沙门氏菌和粪肠杆菌的氧化应激反应(图5)。结果发现，三种损伤细菌(大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪肠杆菌)的ROS产量增加了2.3倍，ROS水平明显高于对照组。同时，为了保护细菌免受ROS的破坏，细胞抗氧化系统，包括CAT活性、SOD活性和GSH-Px活性，被相应地激活。SOD含量在氯损伤菌中显著升高，达4.5倍(p < 0.01)。暴露于氯之前，CAT活性仅在铜绿假单胞菌中表达;加氯后4种细菌均表达，其中阿伯丁沙门氏菌的CAT活性最高，为8.3 U/10 ⁸ cfu。所有未经处理的细菌均未表达GSH-Px活性，但氯损伤的铜绿假单胞菌、阿伯丁沙门氏菌和粪肠杆菌的GSH-Px活性提高了11.3 U/10 ⁸ cfu。这些结果表明，受NaClO影响的细菌发生了强烈的氧化应激反应。

图5 在pH 7.2、20℃条件下，氯损伤菌或非氯损伤菌的氧化应激反应(n = 3;平均值±标准差)。细菌悬浮液(10 ⁸ cfu/mL)，无论是否氯损伤，在20 kHz下超声处理10 min，然后在5000×g，4°C下离心3 min。检测上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的水平。测定10 ⁶ cfu/mL氯伤菌和未氯伤菌体内的活性氧(ROS)，计算其平均ROS倍数变化

在相同的环境条件下，氯杀死的ARB释放的RP4通过自然转化水平转移到氯损伤细菌的频率更高

从杀死的敏感大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌和阿伯丁沙门菌释放的RP4自然转化为耐氯损伤的粪肠杆菌，频率为8.8×10 ⁻⁶ -1.7×10 ⁻⁵ (图6)。与未经NaClO处理的对照组相比，转化频率提高了37-134倍(附录图S4)。

图6 大肠杆菌、铜绿假单胞菌和阿伯丁沙门菌在pH 7.2和20℃条件下自然释放的RP4转化为氯伤粪肠球菌(10 ⁸ cfu/mL)的频率(n = 3;平均值±标准差)。分别用6 mg/L NaClO处理20 min的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和含RP4的阿伯丁沙门菌液(10 ⁹ cfu/mL)，过滤去除ARB后，与10 ⁸ cfu/mL氯损伤或未氯损伤的粪肠杆菌共培养60 min (体积比例1:10)。然后在含有50 mg/L卡那霉素、60 mg/L氨苄西林素和40 mg/L四环素的SOB培养基上，37℃孵育过夜，挑选出转化子

为了进一步探索影响受伤细菌自然转化的重要水质因素，我们观察了pH值、温度、COD _Mn 、NH ₄ ⁺ –N和金属离子等理化参数对上述转化频率的影响(图7，附图S5和S6，附加文献9)。不同理化条件下，被杀死的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和阿伯丁沙门菌释放的RP4向受伤粪肠杆菌转化的频率表明，COD _Mn 、NH ₄ ⁺ -N和金属离子(Ca ²⁺ 和K ⁺ )可以促进粪肠杆菌的生长促进了释放的RP4向损伤菌转化的频率(p < 0.05，n =3，附表S6)。最重要的是，随着NH ₄ ⁺ -N浓度的增加，转化频率增加。当浓度为5 mg/L时，死亡大肠杆菌释放的质粒RP4向受伤粪肠杆菌的总转化频率达到7.9×10 ⁻⁴ 左右，上调了55倍。此外，水体的pH值对释放的RP4转化频率影响较大，pH为7时，RP4从大肠杆菌中释放时，转化频率最高可达2.8×10 ⁻⁵ 。然后，它会随着pH值的增加或减少而下降，在pH值为10时达到零。而温度在4 ~ 37℃范围内的转化频率相似，在3.0 ×10 ⁻⁵ 左右，两者之间无显著差异(p > 0.05，附表S6)。

图7 水质参数影响( NH ₄ ⁺ –N；COD _Mn ;温度；pH值；K ⁺ ；Ca ²⁺ )对大肠杆菌死亡释放的RP4质粒向粪肠球菌转移的影响(n = 3;平均值±标准差)。基线条件如下：10 ⁹ cfu/mL大肠杆菌混悬液(含RP4)经6 mg/L NaClO处理20 min过滤去除ARB后，与10 ⁸ cfu/mL氯损伤粪肠杆菌在不同水质参数条件下共培养60 min (体积比例：1:10)。然后在含有50 mg/L卡那霉素、60 mg/L氨苄西林素和40 mg/L四环素的SOB培养基上，37℃孵育过夜，挑选出转化子

4 Discussion

如今，抗生素的使用、环境温度和城市污水处理厂的规模已被认为是与耐药性在环境中持续存在和传播相关的重要因素。然而，本研究首次发现，氯消毒在过去几年中被用于消除病原体和改善公共卫生，增加了自然转化的频率，并不可避免地通过可培养的氯损伤细菌促进了ARG在细菌属之间的水平转移。从某种意义上说，氯消毒自然加速了细菌属内或细菌属间的基因交换，导致氯化后细菌中ARG的富集。

这一现象的发生是因为饮用水的消毒可以帮助将DNA，包括各种ARGs和移动遗传元件(MGEs)，如质粒、整合子和插入序列，从死亡的供体释放到环境中。清除ARB中所有功能性耐药质粒或ARGs比杀死ARB本身更为困难。该研究还表明，需要更多的NaClO才能去除被杀死的敏感ARB释放的可转移质粒。因此，使用NaClO来降低细菌活力只是满足了“杀死”细菌的必要要求。应该使用更高剂量的NaClO来破坏质粒并进一步分解ARB中的ARGs。考虑到参与ARGs水平转移的MGEs仍然相当难以消毒并保持其生物活性，位于MGEs上的释放ARGs很容易通过物种间的水平转移传播，包括人类病原体。Roller等人报道，即使在二氧化氯 使流感嗜血杆菌细胞失活6倍的情况下，细胞内DNA基本上是完整的。在这里，我们进一步证明，尽管ARB细胞在氯化后实际上已经死亡，但它们的质粒仍然保留了生物活性，并且可以通过转化为其他细菌群落所利用。因此，当进行消毒只是为了灭活细菌或消毒剂量不够时，大量的功能质粒或携带转运蛋白的ARG从死亡细菌中释放出来，这为ARB通过自然转化转移到其他环境细菌提供了很好的机会。

氯化后细菌中ARGs富集的另一个重要原因是工厂的消毒挑战不能完全杀死所有细菌。它诱导对消毒具有强抵抗力的幸存者进入一种生理损伤状态，在这种状态下，他们可以很容易地捕获环境DNA，包括各种ARGs和MGEs。在消毒过程中，从这些受伤细菌周围的敏感细菌中释放出大量的DNA，这使得水平转移发生得更频繁。在本研究中，我们证明了细菌属之间不同程度的氯抗性，然后产生来自更高抗性群体的损伤细菌，并且发现可培养的氯损伤细菌经常可以被杀死的敏感ARB释放的耐药质粒转化。与未经处理的细菌相比，这些可培养的氯损伤细菌的转化频率增加了>550倍，导致消毒后水中iARG的比例远高于消毒前水中。一般来说，由于大肠杆菌细胞对质粒DNA等生物有机大分子具有高通透性，因此常用于细菌转化。因此，这里转化增加的机制可以解释为，由于本研究中氯损伤的大肠杆菌中发现细胞膜通透性增加，氯损伤的细菌也变得有能力，使质粒更容易摄取。此外，Khan等人发现的自来水中细菌共选择消毒抗性和抗生素抗性的现象。这可能是由于抗氯损伤细菌通过自然转化从非ARB向ARB转变。此外，使用对大肠杆菌致死但对粪肠杆菌亚致死的氯剂量，可能产生受伤的粪肠杆菌，它们可以吸收死亡的ARB释放的耐抗生素质粒，导致抗生素耐药性在细菌属中传播。由于肠球菌引起生物膜相关的机会性感染，如伤口和感染性心内膜炎，因此通过氯化过程促进释放的质粒自然转化为氯损伤的粪肠球菌可能对公众健康构成潜在风险。此外，上述结果表明，使用大肠杆菌来确定饮用水的卫生质量并不理想，特别是用于判断粪便污染或预测可能存在的水传播病原体。考虑到它会导致细菌灭活不足，产生可培养的氯损伤细菌，这些细菌比大肠杆菌对氯的抗性更强。这些微生物可以在氯暴露中存活，并通过自然转化增强ARG在细菌属之间的转移。

最后，环境污染物COD _Mn 、NH ₄ ⁺ –N和金属离子(Ca ²⁺ 、K ⁺ )可以提高被杀ARB释放的质粒RP4向可培养氯损伤菌转化的频率。一般来说，浮游细胞在有机营养丰富的情况下，细胞生长能力急剧下降。然而，在环境中有有机物存在的情况下，受氯损伤的细菌仍然可以被诱导为能态，这表明它们也可能进入一种营养饥饿状态，类似于在生物膜状态下的大肠埃希菌细胞。Ca ²⁺ 是最典型的能态诱导因子之一。它们通常被认为是在细胞表面诱导形成孔状结构，以供完整双链DNA的传递。在PEG6000存在的情况下，Na ⁺ 、K ⁺ 等碱阳离子对大肠杆菌的转化也均有效。Liu等人发现，在氯化过程中，观测到的iARGs总浓度变化与NH4 ⁺ -N浓度呈强正相关。Zhang等人发现，NH ₄ ⁺ -N浓度越高(15 mg/L)，ARGs去除率越低。因此，外部环境因素作为细菌的DNA摄取机制之一，可能在氯化过程产生的ARGs水平转移中起重要作用。说明在消毒前对水质进行控制是控制ARG污染的有效方法。

实际上，促进细菌之间的共轭转移也可能有助于氯化后成品水中iARG水平的富集。为了确定氯对总转化事件的影响，我们还进行了一项实验，用NaClO处理供体细胞(具有RP4的大肠埃希菌，对卡那霉素、氨苄西林素和四环素耐药)和受体细胞(粪肠杆菌，对萘啶酸耐药)的共培养物(附录文本10)。结果显示(附表S7)，即使暴露于6-7 mg/L NaClO后，与对照组(无氯)相比，活粪肠杆菌(耐卡那霉素、氨苄西林素、四环素和萘啶酸)的转化子数量也增加了8.3-8.7倍。但考虑到在对照组(两种细菌混合)的情况下不应发生遗传转化，因此假设在对照组中大肠杆菌与粪肠杆菌之间发生了接合转移。因此，除了基因转化外，混合菌接触氯后的变形菌数量增加，也可能来自于促进菌间的接合转移。

综上所述，与相应的未经处理的细菌相比，具有生理能力的耐氯损伤细菌表现出更高的质粒转化频率。由于被杀死的敏感抗生素耐药细菌释放的可转移质粒通过消毒具有一致的抗降解能力，氯化过程可以促进释放的质粒通过自然转化水平转移到氯伤菌中，并导致ARG在活菌中富集。环境污染物、COD _Mn 、NH ₄ ⁺ -N和金属离子均能增强这一过程。这些结果表明，氯消毒自然加速了细菌属内或属间的基因交换，使氯损伤的条件致病菌在氯化过程中可以通过自然转化从非ARB转移到ARB，从而具有在水中传播抗生素耐药性的潜在风险。

来源： 王玮课题组 WW Lab 。 投稿、合作 、转载、进群，请添加小编微信Environmentor2020！环境人Environmentor是环境领 域 最大的学术公号 ，拥有近 15W+活跃读者 。由于微 信修改了推送规则，请大家将环境人Environmentor加为 星标 ，或每次看完后点击页面下端的 “在看” ，这样可以第一时间收到我们每日的推文！ 环境人Environmentor现有综合群、 期刊投稿群、基金申请群、留学申请群、各研究领域群等共20余个，欢迎大家加小编微信Environmentor2020，我们会尽快拉您进入对应的群。

往期推荐

论文推介

ES&T主编/副主编：我的论文为啥未送审就被拒稿？