Advanced Science（IF 14.3）：中科院刘芝华团队利用三代测序技术解析肿瘤转移中空间异构体作用

Advanced Science 上发表的“Spatial Isoforms Reveal the Mechanisms of Metastasis”通过 将Spatial isoform transcriptomics（SiT）与第三代测序技术（长读长测序）结合，发现CD74 isoform比率可作为预测食管鳞状细胞癌化疗耐药性和转移的生物标志物，针对该isoform的mRNA药物可能有助于预防化疗耐药性和转移。

方法

数据来源： 从已有研究获取ESCC单细胞数据；转录组和临床数据来自 HRA003107 和 TCGA-ESCC ；对1例转移和化疗耐药患者的肿瘤组织和LN组织进行 ScRNA-seq、TCR 和 SiT测序；13位 ESCC患者的肿瘤样本进行 SiT测序，作为验证队列。

单细胞转录组分析： 使用 CellRanger 处理测序数据，Harmony 进行去批次效应后，用R包Seurat 进行后续分析，由标记基因进行细胞注释。

空间转录组分析： 使用 SpaceRanger 处理测序数据并比对人类基因组（hg38），R包Seurat 进行后续分析；Create3DStack 函数处理后数据使用 STutility包进行3D可视化；使用 stlearn进行配体-受体互作分析和空间轨迹分析。

SiT分析： 使用Guppy 处理测序数据并用 minimap2比对人类基因组；Seurat包的 FindMarkers 函数进行差异剪接检测并根据 isoform 与相应基因的关系和空间分布模式进行分类。

单细胞TCR分析： 使用 CellRanger处理测序数据并比对 vdj_GRCh38_alts_ensembl-7.0.0；R包scRepertoire 用克隆丰度注释 Seurat对象；EnhancedVolcano包生成火山图。

CNV评估： 使用R包InferCNV 来估计每个点和每个分析基因/染色体位置的CNV。

蛋白结构预测： 使用 AlphaFold2 预测 CD74 isoform 的蛋白质结构。

结果

为了探究isoform水平和化疗反应的关联，研究对同一患者化疗前的肿瘤样本（Before）、化疗后肿瘤样本（After）和化疗后淋巴结样本（AfterLN）进行了测序并比较短、长读两种测序方法的空间转录组数据。三个样本中共检出87277个独特 isoforms，平均每个空间点有763个。其中， AfterLN每个空间点的 isoforms 密度最高，表明该样本存在明显的分子异质性。

空间聚集区域被称为生态位。两种方法的生态位聚类模式相似，表明它们可以互相验证和支撑，增强了结果的可靠性。随后，研究将 isoform 分为 multi-all、multi-one、multi-others 和single，其中大部分 isoform 为 multi-others（图1B）。在表达TOP15%的 multi all 中，研究识别出不同表达模式四种isoform类别：转移阴性、转移阳性、耐药性和治疗靶标（图1C）。这些isoform主要来源于RPS和RPL家族，其中RPS9 isoforms表达水平在所有样本中均上升（图1D，E）。

图1

为了阐明ESCC转移期间以及治疗前后的细胞动态，研究通过聚类识别出17个细胞簇，其中单核细胞/巨噬细胞在化疗后比例下降（图2A，B）。鉴于TAMs可抑制细胞毒性T细胞，研究进一步将单核细胞/巨噬细胞聚类为 C1QC+TAMs 和 FCN1+其他单核细胞/巨噬细胞，并发现C1QC+TAMs 高表达CD74、APOE、HLA-DRA1等基因（图2C-E）。仔细检查T细胞功能和比例，研究发现 CD8+CXCL13+Tex 细胞表达细胞毒性和耗竭相关基因，并且在化疗后比例下降（图2F）。此外，研究还发现MIF在调节T细胞功能方面起着重要作用，高水平的MIF表达会降低 CD8+CXCL13+Tex 细胞的细胞毒性（图2G）。 细胞互作分析表明，C1QC+TAMs与CD8+CXCL13+Tex细胞之间有强互作，且MIF-CD74相互作用在其中起关键作用 （图2H-K）。

图2

为全面理解肿瘤与转移性LNs内的空间生态位及细胞分布情况，研究将空间转录组点分类到空间生态位中（图3A）。通过统计每个空间点与最近六个相邻空间点不同的生态位数量，研究发现化疗后肿瘤和淋巴结样本中空间生态位之间的接触频率较化疗前高，表明化疗后免疫细胞和恶性上皮细胞之间的相互作用增强（图3B）。此外，研究还发现化疗对于肿瘤中恶性上皮细胞的CNV事件有一定抑制作用，但对化疗耐药性LNs无效。在空间分布方面，肿瘤和淋巴结中存在 CD8+CXCL13+Tex 细胞和 C1QC+TAMs 的富集，而且在淋巴结中这种富集更加明显，并且通过多个起点扩散（图3C-G）。总之， 化疗对于肿瘤和淋巴结的空间肿瘤微环境有不同程度的影响，且淋巴结中T细胞和巨噬细胞的富集程度更高。

图3

为了阐明可变剪接在 CD8+CXCL13+Tex 细胞和 C1QC+TAMs 空间关系中的作用，研究确定了包含这两种细胞类型的点并按CD74变体比率（CD74-201/CD74202）进行分类（图4A、B、H、I）。在Before样本中没有这两种细胞类型的点，也没有含高CD74变体比率的点，但After和AfterLN样本富含 CD8+CXCL13+Tex 细胞和 C1QC+TAMs（图4C、D、J、K）。此外，在After和AfterLN样本中，CD74-202/CD74-201 比率组能够显著地指示 CD8+CXCL13+Tex 细胞和 C1QC+TAMs 的富集程度（图4E、L）。所有比率组之间的富集分数存在显著差异，且富集点 CD74-202/CD74-201 比率也显著高于其他点（图4F、M、G、N）。随后，研究通过分析验证队列和 BaseScope 原位杂交进行了验证（图4O-S）。总之， CD74 isoform比率的增高与 CD8+CXCL13+Tex 细胞和 C1QC+TAMs 的富集存在一致性，这可能与CD74变体的结构差异有关。

图4

为了验证 CD8+T 细胞的分化轨迹，研究进行了拟时序分析，并且发现 CD8+CXCL13+Tex细胞和 CD8+Tem 细胞起源于 CD8+Tcm 细胞（图5A、B）。随着 CD8+T细胞的分化，CCL4、CCL5、CD8A和GZMK 的表达增加，而CXCL13 仅在 CD8+CXCL13+Tex 细胞和一些CD8+Tcm 细胞中表达（图5C）。通过单细胞TCR测序分析，研究发现 CD8+CXCL13+Tex 细胞是唯一具有超扩增克隆型丰度的细胞类型。TCR克隆性和多样性的增加，CD74表达也增加。CD74亚型比例与TCR克隆性和T细胞命运呈正相关。通过 分析空间表达数据中表达趋势的变化，研究进一步证实 CD74 isoform 比例与TCR克隆性和T细胞命运呈正相关 （图5D、E）。

图5

为验证 C1QC+TAMs 与 FCN1+ 单核细胞/巨噬细胞的相互作用，研究对涵盖UVM、BCC和ESCC的单细胞数据集（GSE123814、GSE139829和GSE203067）进行了分析。在三种上皮癌中，C1QC+TAMs 与 CD8+CXCL13+Tex 细胞之间的相互作用被验证（图6A-G）。其中，MIF-(CD74+CD44) 互作最有可能发生，MIF、CD99、ITGB2 和 MHC-II 四种相互作用反复出现。CD74的表达水平与 C1QC+TAMs 的比例可能能够预测PD-1阻断治疗的反应和转移的发生。此外，在 TCGA-ESCC 和 HRA003107 队列中，C1QC+TAM 标记的表达与患者的生存率呈负相关，且与肿瘤分级和分期有关（图6H-J）。总之，这些结果验证了 C1QC+TAMs 与 CD8+CXCL13+Texs 细胞在上皮癌中的相互作用，并且为进一步的机制研究提供了有价值的参考。

图6

结论