蓝晶实验室·iGEM项目解读系列 | 2010 Peking

水是生命之源，由于人类活动带来的水体重金属污染，已成为世界范围内累积的趋势。要想解决这一问题，即实现对自然水体中重金属离子的检测和去除，现行的传统方法不仅价格昂贵、耗时，且对于低浓度的重金属污染物束手无策。因此，我们需要提出价格经济且能在复杂的自然水体环境中仍然有效的新方法。北京大学2010年的iGEM队伍开发出了一种具有检测和去除双重功能的微生物试剂盒，以期实现对自然水体中重金属污染物的去除。

项目漫画——具有检测（reporter）和吸附去除（absorbent）功能的微生物宝盒

生物传感器是一类由生物传感元件组成的检测设备和系统，这些元件可以识别物理化学变化，并将感知到的变化转换为可测量信号，从而实现检测。传统方法检测水体重金属污染使用的是化学试剂盒，灵敏度低且价格昂贵。而由微生物组成的生物传感器不仅容易制造而且价格相对低廉，还具有较高的灵敏度，是近年来备受追捧的检测新星。一些发展中国家和地区的饮用水存在砷（又称“砒霜”）污染的问题，实验室和实地研究表明细菌生物传感器对砷检测下限可达10 µg，远低于饮用水的标准。

一个典型的生物传感器包括感应模块（sending module）、信息处理模块（computing module）和输出模块（output actuating module）。北大2010 的队员们选取了普遍存在于细菌基因组中的MerR家族转录因子来充当感应模块和信息处理模块，负责识别并将外界信号转化为细胞内的转录信号。MerR原本是细菌用来感知生存环境中的有毒物质或超出可承受浓度范围的金属离子的重要转录因子，该家族成员可以检测包括 Cd ²⁺ , Zn ²⁺ , Co ²⁺ , Cu ⁺ , Ag ⁺ , Au ⁺ , Hg ²⁺ 和 Pb ²⁺ 多种金属离子。队员们最终选择了来自福氏志贺氏菌（ Shigella flexneri ）质粒R100上的MerR， 该蛋白可特异性地检测浓度低达10 ^{- 8} M的Hg ²⁺ 。

MerR家族蛋白的功能

原始的MerR 是 mer 解毒基因簇的转录因子， Hg ²⁺ 与MerR二聚体结合后可改变其构型，进而使RNAP可结合到启动子区域，开启下游基因的转录。北大2010 的队员们通过对野生型的mer操纵子启动子区域进行改造，删除了MerR基因的启动子PR的-35区，在其后面接上GFP，同时将MerR基因组装到带有组成型启动子的另一载体，成功地构建了可以检测Hg (II)的工程菌。通过检测该工程菌在不同Hg (II)浓度（ 10 ^-9 ~10 ^-5 M）的诱导下的GFP表达强度发现：PTPCAD（merTPAD的启动子）的本底表达非常低，Hg (II)对GFP的诱导表达是剂量依赖的，且在此浓度范围内不造成细胞毒性。同时，通过以Pb (II)为阴性对照，发现此诱导是具有特异性的。由此可见，该生物检测器不仅灵敏度非常高且具有特异性。

mer 操纵子启动子区域。（A）蓝色框内的PTPCAD启动子和紫色框内的PR启动子一起组成merOP，MerR以二聚体的形式结合到merOP，可同时抑制两个方向基因的转录，其中PTPCAD启动子可被激活，而PR不能。（B）红色框内为最终选取用于实验的启动子序列（PTPCAD），删除了PR的-35区。

a.不同Hg (II)浓度下GFP表达强度随着时间的变化。b. 不同Hg (II)浓度下OD值随着时间的变化。

通过PCR对启动子的半保留区域（在反向重复序列外围，突变后该区域仍能被转录因子识别和结合，但会影响结合的紧密程度）进行突变，构建启动子突变库，再结合表征实验，发现MerR对操作子（operator）的亲和力会显著影响细菌对Hg (II)的敏感程度。此外，当MerR表达量过高时，部分MerR二聚体将处于未与Hg (II)结合的游离状态，也会影响该生物传感器对Hg (II)的敏感性。通过改变启动子的强弱及所在质粒的拷贝数，控制MerR的表达量，结果发现MerR的表达量越高，该生物传感器可检测的Hg (II)浓度下限越高。

如何将该生物传感器的检测结果呈现出来是该团队接下来要解决的问题。他们巧妙地设计了一个被称为“交通信号灯”的生物报告系统，该系统以上述实验构建的不同细菌细胞作为检测器，这些细菌细胞有相同强度的输出信号但对Hg (II)有着不同的检测下限；结合Laz报告系统，在96孔板中进行实验，便可通过肉眼观察得知污水中Hg (II)的浓度（图 6）。该系统无需校正，并且初步的实验结果也展示出了该系统的应用潜力，可满足世界健康组织对饮用水中所能接受的Hg (II)最高浓度（ 10 ^-8 M ）。

96孔板中进行的交通信号灯实验。选取其中一株菌株进行了严格的重复实验，以全细胞为感应器，向96孔板中加入含有不同浓度Hg (II)的污水，结果显示该菌株可检测的浓度下限为 7*10 ^-9 M ，且实验结果重复性好。

进一步地，北大2010队伍在数学建模的指导下设计了一个更精确的检测系统——Tri-Node Response System。该系统通过引入B极（受MerR调控表达的激活子），调整MerR的表达强度及MerR与PmerT的结合强度，便可实现将希尔方程由非线性转换为线性。

Tri-node response system的结构。A极可产生MerR蛋白；B极可产生一个激活子，可激活Psid启动子；C极在Psid和PmerT趋动下可产生GFP。