纳米孔技术：从单分子视角探索生命的复杂性

在生命科学研究中，生物体由数以千万计的分子协同作用，共同维持系统的稳态、应对外界压力并调控各项生理功能。然而，细胞内的高度异质性使得传统的单细胞组学和空间组学方法难以全面揭示分子间复杂的相互作用与动态变化。随着单细胞组学和多组学技术的不断发展，研究人员们逐渐意识到解析分子时间动态的重要性——即研究分子在时间维度上的变化过程。这正是“单分子时间组学”（single-molecule temporal omics）所要解决的核心问题。

单分子时间组学

单分子时间组学的目标是在时间维度上追踪单个分子的动态变化，以揭示细胞内部复杂的生物学过程。例如，单糖基化修饰的异质性可以引起蛋白质功能的多样性，而细胞外蛋白稳态的失调可能是神经退行性疾病（neurodegenerative diseases）如阿尔茨海默病和帕金森病的关键诱因。为了解析这些复杂的生物过程，研究人员需要一种具有高时空分辨率的技术，能够在单分子水平上实现对分子动态变化的精准监测。纳米孔技术（nanopore technology）正是这样一种有力的工具。

空间组学和时间组学领域取得的最新进展（Credit: Nature Methods）

图中使用不同颜色和符号标记了各个工作，以表示其发表年份和组学类型。详细描述了空间和时间组学技术在不同时间点上的发展情况，包括基因组学（Genomics, G）、表观基因组学（Epigenomics, E）、转录组学（Transcriptomics, T）、蛋白质组学（Proteomics, P）、分泌组学（Secretomics, S）以及多组学（Multi-omics, M）。以及不同组学技术在空间和时间分辨率上的进展，提供了关于每项组学分析的时间间隔和空间细节的范围信息。

纳米孔技术

纳米孔技术最初用于单分子核酸测序，但如今它的应用已经扩展至蛋白质检测、化学反应监测和生物物理特性分析等多个领域。纳米孔是一种微小的孔道，当单个分子穿过该孔道时，离子电流会发生变化。通过精确监测这种电流变化，研究人员可以无标记地逐一识别分子的质量、构象及其化学修饰状态。因此，纳米孔技术被视为“单分子质谱”（single-molecule mass spectrometry, MS），在单分子层面上揭示分子异质性和时间演化。

纳米孔技术的应用已经取得多项突破。例如，研究人员利用α-溶血素（α-hemolysin）纳米孔成功区分了聚乙二醇（PEG）分子中的单个乙二醇单位。通过分析单分子穿过纳米孔时的残余电流（I/I0），验证了纳米孔在单聚合物单位分辨方面的可行性。此外，通过调整盐溶液的浓度，进一步提高了质量识别的分辨率，并将可区分的PEG聚合度范围扩展至25至50单位。

纳米孔技术也在蛋白质研究中发挥了重要作用。例如，研究人员利用化学修饰的纳米孔实现了对不同蛋白质构象的区分。通过对蛋白质在纳米孔内通过时电流变化的详细分析，可以区分其折叠状态、部分展开状态及完全展开状态。这些研究为理解蛋白质折叠及其动态过程提供了新工具，对于与蛋白质错误折叠相关的疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）的研究具有重要意义。

单分子异质性与时间动态

生物过程本质上是由单个分子依次进行的，这意味着这些过程具有内在的动态特征。为了全面理解生命的复杂性，必须从单分子和时间动态的角度进行考察。例如，糖基化的异质性会导致蛋白质功能的多样性，而细胞外蛋白稳态的失调与神经退行性疾病密切相关。

纳米孔技术在分子水平上检测异质性和时间动态方面具备独特优势。例如，纳米孔可以检测单个生物大分子的构象或化学修饰状态差异，如识别糖基化和磷酸化修饰，从而帮助研究人员理解这些修饰如何随时间影响分子的功能。在研究中，研究人员利用带有高浓度正电荷的气溶素（aerolysin）纳米孔，显著延长了带负电荷的单链DNA（ssDNA）在纳米孔中的停留时间，从而实现了高分辨率的单分子质量识别。

此外，纳米孔还可以用于实时追踪分子间的相互作用。例如，通过在纳米孔中引入特定的配体，研究人员可以研究蛋白质-配体相互作用的动力学。利用纳米孔的高时间分辨率，能够精确测量每次结合与解离事件的时间，从而提供关于结合亲和力和结合速率的详细信息。这对于药物开发具有重要意义，因为它可以直接测量候选药物与目标蛋白之间的结合动力学参数，从而优化药物的选择和设计。

纳米孔系统用于单分子质量识别的原理和应用（Credit: Nature Methods）

纳米孔时间组学的应用及其挑战

在复杂生物样本中应用纳米孔时间组学面临许多挑战和机遇。例如，在检测复杂生物样本中的单分子异质性时，纳米孔技术需要具备极高的事件特异性。目前，残余电流或相应的残余电平被视为识别混合样本中分子类型和状态的主要参数。然而，由于纳米孔中的离子电流受到多个因素的影响，某一残余电流可能对应多个不同的分子。

为了提高事件特异性，研究人员提出了多种策略。例如，通过结合机器学习算法，可以从纳米孔电流事件中提取更多特征，如电流的标准差、时间频谱及电流事件的形状等。这些附加特征有助于提高复杂生物样本中分子的识别准确性。特别是，深度学习算法在自动分析纳米孔信号方面展现出巨大潜力，能够在没有人为干预的情况下自动分类和识别不同类型的分子，从而提高检测的效率和准确性。

此外，生物样本中目标分子的低浓度要求显著提高纳米孔的检测限（limit of detection, LOD），以确保在复杂生物系统中应用单分子时间组学。在实验中，研究人员通过电渗流（EOF）机制提高了中性肽段的捕获效率，从而显著增强了检测灵敏度。这种方法通过精确调控纳米孔管腔的几何结构和电荷密度，使得不同类型的分子在同一偏压下能够高效捕获。

进一步的研究表明，通过在纳米孔上结合特定的生物识别元件（如抗体或DNA适配体），可以显著提高目标分子的捕获效率和特异性。例如，通过在纳米孔的边缘修饰抗体，研究人员能够专门捕获目标抗原分子，这对于疾病的早期诊断具有重要意义。此外，通过结合适配体，纳米孔可以实现对特定核酸序列的选择性识别，这对于病毒检测和基因组研究具有重要应用。

尽管纳米孔技术在实现单分子时间组学方面面临诸多挑战，但其在临床应用和基础研究中的潜力不容忽视。单分子特征的提高使得纳米孔在临床检测中可以发挥重要作用，尤其在检测复杂环境中的低丰度物质（如生物标志物和新抗原）方面表现出色。结合单细胞技术，纳米孔时间组学预计将提供足够的空间分辨率，从而评估生物系统的时空演化，帮助理解复杂的分子相互作用和调控网络，发现更精确的生物标志物，并推动疾病治疗的进展。

结合纳米孔和纳米注射器（nanopipettes）的技术，通过纳米注射器从单个活细胞中提取分子样本，并通过纳米孔实时检测这些分子的组成。这种技术的整合使研究人员能够在不破坏细胞的情况下记录其分子的动态变化，为单细胞时间组学的研究提供了新的可能性。

此外，纳米孔技术在单分子药物筛选方面的应用也备受瞩目。通过将候选药物分子通过纳米孔，可以实时监测其与目标蛋白的结合情况。由于纳米孔的高时间分辨率，可以测定药物与蛋白质之间的相互作用强度及结合稳定性。这些信息对于药物设计和优化至关重要，特别是在个性化医疗领域，纳米孔技术有望用于筛选对特定患者最有效的药物，从而提高治疗的精准性和有效性。

纳米孔技术不仅是一种用于DNA测序的工具，其应用范围已经大大扩展，未来甚至有望解决生物学中的根本性问题和临床中的实际挑战。尽管单分子时间组学的实现仍需持续努力，但随着纳米孔技术、纳米注射器（nanopipettes）以及表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy）等技术的不断进步，单分子时间组学的应用前景愈加广阔。纳米孔技术与单细胞技术的结合可能在生命科学的各个领域中发挥重要作用，为探索和理解生物系统的复杂调控机制提供新的视角和方法。