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国自然加分新技术之——Smart-seq技术

猫头鹰教室 · 公众号 · 科技自媒体 · 2024-12-22 12:30

主要观点总结

本文介绍了单细胞测序中的Smart-seq技术，包括其发展历程、技术特点、样本类型、应用领域以及国自然基金申请情况。重点阐述了Smart-seq、Smart-seq2和Smart-seq3技术的迭代更新和优势，以及它们在单细胞转录组研究中的应用。

关键观点总结

关键观点1: Smart-seq技术介绍

Smart-seq是一种单细胞转录组测序技术，可以获取单个细胞内近万个基因的特异表达信息，解决bulk测序无法解决的细胞异质性难题。

关键观点2: Smart-seq技术的迭代更新

Smart-seq技术经历了Smart-seq、Smart-seq2到Smart-seq3的迭代更新，技术不断优化，能够构建全长转录本，提高扩增精准度和产量。

关键观点3: Smart-seq技术的应用领域

Smart-seq技术在肿瘤微环境及免疫学、精细化表达图谱绘制、早期胚胎发育研究以及植物单细胞研究等领域有广泛应用。

关键观点4: 国自然基金中单细胞测序技术的应用

随着技术的突破与发展，国自然研究课题中涉及单细胞测序技术越来越多，包括炎症、肿瘤免疫、肿瘤异质性等方面的研究。

正文

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提到高通量测序，我们比较熟知的就是 RNA-seq ，它是通过提取组织、器官以及一群细胞的混合 RNA （ bulk RNA ）进行测序，得到的是一群细胞转录组的平均数据，这往往忽略掉了细胞群体中单个细胞特异表达的基因信息。随着科技的发展以及需求的增加，单细胞测序技术于 2009 年应运而生，并于 2013 年被《 Science 》杂志评为未来几年最值得关注且可持续发展的技术领域之一。 单细胞转录组测序（ Single cell RNA sequencing ， ScRNA-Seq ） 是一项在单细胞水平对转录组进行高通量测序和分析的新技术 ，可获得单个细胞内近万个基因的特异表达信息，同时解决 bulk 测序无法解决的细胞异质性难题，为辨别生物组织中各细胞的转录组特征、解析单细胞的行为、机制及其与机体的关系提供有力的工具。单细胞测序种类繁多，但转录组测序主要分为两个大方向：①更多的细胞，如 10x 技术平台，可以构建海量的单细胞测序文库（ 100000 级别），但是只能获取 mRNA 的 3 ’端信息，也就是说只能获取转录本的部分信息；②测更多的基因，如 Smart-seq 技术可以获得完整的 mRNA 信息。今天小编就带大家来了解一下单细胞测序中的 Smart-seq 技术。

1.Smart-Seq技术的迭代更新

Smart-Seq 技术

为什么说 S mart -seq （ Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript ）是可以测更多的基因呢？ Smart-seq 其实是可以对单个细胞 RNA 的基因亚型、等位基因等进行大规模测序，并检测 mRNA 全长的一种单细胞转录组测序技术，它由美国和瑞典科学家共同开发。这种能够从单细胞生成全长 cDNA 的测序方案，对于等位基因特异性表达、 SNV 检测或者剪接变体等深入研究来说，具有里程碑意义。但由于当时的技术限制，怎么可能完美无缺呢？所以 Smart-seq 技术也存在一定的缺陷，如对一些低丰度的转录本扩增效率不佳；同时由于引物的设计问题也可能影响后续纯化及需要更多的细胞进行初步 RNA 提取等，但就当时而言，该技术已经是获得完整转录本的最佳单细胞测序方案。

Smart-Seq 技术的发展史

Smart-seq 技术于 2012 年由 Ramsköld 团队发表； Smart-Seq2 技术于 2013 年及 2014 年由 Picelli 团队改进并发表； Smart-seq 3 技术则于 2020 年由瑞典卡罗林斯卡学院的 Rickard 团队进一步改进并发表。那么接下来我们就具体看一下 Smart-Seq2 和 Smart-seq 3 技术相对于 Smart-seq 初代技术有什么改进 ~

2.Smart-Seq2技术

Smart-seq2 技术于 2013 年被发表于《 Nature Methods 》，在 Smart-seq 技术基础之上，通过使用一种模板切换引物探针（ TSO ）并将其 3' 末端最后一个鸟苷酸替换为锁核酸（ locked nucleic acid ， LNA ），结合更高浓度的 Mg ²⁺ 和甜菜碱，提高扩增精准度的同时产量也跟得上，只需要 50 pg 级别的 RNA 即可满足构建测序文库的需求，同时通过改善 MMLVRT 和 TSO 引物，提高转录本的整体覆盖度，实现了高水平的序列模板转换。

技术优势

（ 1 ）更强的 3' 端 延伸能力 ：通过逆转录在 cDNA 链的 TSO 引物（ rGrG+G ） 3' 末端最后一个鸟苷酸替换为 LNA 。增强了热稳定性，在更强的退火温度下，使得非模板 cDNA 的 3' 端进一步延伸，完善了转录本的覆盖能力。

（ 2 ）更高的 cDNA 产量： 新体系中添加了甜菜碱，可通过提供甲基来增加蛋白酶的热稳定性，并通过破坏 DNA 螺旋结构消除 DNA 热融变对碱基对组成的依赖性；同时体系中增加的 Mg ²⁺ 浓度可以保证其与甜菜碱羧酸盐阴离子结合形成离子对，进一步成为 DNA 稳定剂，在一定程度上提高 cDNA 产量

（ 3 ） 更多的加热循环： 额外增加 10 个加热循环（ 50 ℃ 2min;42 ℃ 2min ）解开了 RNA 的二级结构（例如发夹或环），解决了空间位阻导致的酶终止链延长问题。

（ 4 ） 更广的应用范围： M-MLV 逆转录酶更倾向于选择全长 cDNAs 作为其末端转移酶活性的底物，其在转录到 mRNA 的 5 ’末端时，会在新合成的 cDNA3 ’末端，多出几个 C 碱基，使得 TSO 引物与第一链结合高效合成全长 cDNAs ，因此每个转录本的所有外显子都能被检测到， 后续还可分析可变剪切，还可在转录本层面进行 SNP 和突变位点分析。

图 1 Smart-seq 2 技术建库流程图

3.Smart-Seq3技术

相较于 Smart-seq 2 技术， Smart-Seq 3 的建库原理其实大体一致，不同点在于在 Tn5 酶的 tag 后面添加了 UMI 序列，利用独特的手法构建转录组，主要是挑选 5 ’ UMI 序列的双端序列，将具有相同 5 ’端的序列与不同 3 ’端的序列进行合并，达到延伸转录本的目的， Smart-seq3 构建的文库长度主要分布在 600-2000bp 之间。因此，对于普通单细胞转录组来说， Smart-Seq 3 技术得到的转录本长度大大增加了，为单细胞水平转录组特征的研究提供了强有力的工具。

技术优势

与 Smart-seq2 相比， Smart-seq3 的技术优势如下：

（ 1 ）更长的转录本： Smart-seq2 技术在建库时对于转录本长度具有一定的偏向性，大于 4kb 的转录本建库效率较低，而 Smart-seq3 技术的建库文本长度主要分布在 600-2000bp 之间，很好的弥补了 Smart-seq2 技术的这一缺点。

（ 2 ）更高的灵敏度： 首先， Smart-seq3 在建库前期加入了 UMI ，这种实验方法提高了对单个细胞的分辨能力；其次， Rickard 等人发现， Smart-seq3 在 SNP 分型上的检出显著性高于 Smart-seq 2 ，且 Smart-seq3 对于基因、编码蛋白、 lncRNA 等检出的显著性都明显高于 Smart-seq 2[1] 。

（ 3 ）更低廉的成本： Smart-seq3 的成本相较于 Smart-seq2 降低了很多，可以达到单个细胞在 0.5-1 欧元左右，而 Rickard 等改良的 Smart-seq3xpress 技术更是将单个细胞成本降至 0.25 欧元 [2] 。

图 2 Smart-seq 3 技术建库流程图

4.样本类型

样本来源

真核生物的新鲜样本，包括人或小鼠的新鲜组织、细胞系、原代细胞、外周血单核细胞等。

样本量

推荐 1~100 个细胞 / 样本，生物学重复建议不少于 3 个。

细胞质量：细胞活性＞ 80% ；有核率＞ 70% ，结团率＜ 10% 。

5.技术应用领域及国自然申请中的应用情况

应用领域

单细胞转录组测序能够精准反映细胞间的异质性，不但可以预测细胞分化与研究发育轨迹，在各种疾病、免疫、肿瘤、神经科学等领域以及组织、器官、发育研究中发挥着重要作用，实现了对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测，具有广阔的应用前景。

（ 1 ）肿瘤微环境及免疫学研究： 肿瘤细胞由于基因突变和表达谱不同而产生的肿瘤细胞亚型，肿瘤中心的细胞，肿块边缘的细胞和肿块周围的细胞，乃至远端转移的细胞，其转录组等遗传信息存在差异，借助 Smart-seq 技术获得不同亚型肿瘤细胞的基因表达数据，为癌症患者的诊断、临床治疗以及疾病机制研究提供有力的数据基础。除此以外，该技术还可在免疫学研究中针对少量分选的细胞，扩增出每个单细胞全长转录本，从而获得针对不同抗原的免疫细胞的特异性表达信息，实现肿瘤组织的免疫学研究。

（ 2 ）绘制精细化表达图谱： Rickard 等研究发现 [1] ，使用人类细胞图谱（ HCA ）基准样品（包含人外周血单核细胞（ PBMC ）， HEK293T ，小鼠 NIH3T3 ，狗 MDCK 细胞）进行 Smart-seq3 测序，发现物种细胞类型可被清楚分离，使传统较难分离的细胞类型被分离，实现了对特定细胞的更高精准度的转录本覆盖，进而可以绘制精细的单细胞表达图谱。

（ 3 ）其他应用： Smart-seq2 技术还可通过应用有限的细胞，检测早期胚胎发育过程中不同阶段的基因表达的差异；同时也可将该技术用于植物单细胞研究。由于有些植物单细胞体积过大或过长，并不适合 10x 平台，因此可借助流式或者显微分选出单细胞后，通过 Smart-seq2 技术分析植物特殊细胞、繁殖体形成过程中单个细胞层面的特异性基因表达信息。

国自然基金中的应用情况

在国自然申请过程中，单细胞测序技术的应用情况又是怎样的呢？随着技术的突破与发展，国自然研究课题中，涉及诸多热门技术，也包括单细胞转录组测序技术。小编我通过检索并分析中标题目后发现，近几年关于单细胞测序的国自然基金中标项目中，包括但不限于炎症、肿瘤免疫、肿瘤异质性以及肿瘤微环境等方面的研究，包括浙江大学、复旦大学、中山大学已经有单细胞组学相关技术的研究课题，图 4 中单细胞测序申请数量虽然在 2022 年有所下降，但总体还是呈现增长趋势，相信 2023 年以后，将会涌现更多基于单细胞测序的研究课题。

图 3 单细胞测序国自然中标题目

图 4 单细胞测序技术国自然年度中标量

6.总结

总之， Smart-seq/2/3 技术作为可构建全长转录本的单细胞技术之一，可帮助研究者们探究单细胞水平上的转录本特性，为我们研究细胞的异质性、细胞发育、肿瘤微环境、精准医疗带来了巨大的进步，实现了从混合细胞到单细胞的水平研究的跨越，进一步揭示了生物体微观视野的变化规律。

参考文献

[1]Hagemann-Jensen Michael,Ziegenhain Christoph,Chen Ping et al. Single-cell RNA counting at allele and isoform resolution using Smart-seq3.[J] .Nat Biotechnol, 2020, 38: 708-714.

[2]Hagemann-Jensen Michael,Ziegenhain Christoph,Sandberg Rickard,Scalable single-cell RNA sequencing from full transcripts with Smart-seq3xpress.[J] .Nat Biotechnol, 2022, 40: 1452-1457.

[3]Sun Yu-Meng,Chen Yue-Qin,Principles and innovative technologies for decrypting noncoding RNAs: from discovery and functional prediction to clinical application.[J] .J Hematol Oncol, 2020, 13: 109.

[4]Wang Nayi,Zheng Ji,Chen Zhuo et al. Single-cell microRNA-mRNA co-sequencing reveals non-genetic heterogeneity and mechanisms of microRNA regulation.[J] .Nat Commun, 2019, 10: 95.

[5]Pai Joy A,Satpathy Ansuman T,High-throughput and single-cell T cell receptor sequencing technologies.[J] .Nat Methods, 2021, 18: 881-892.

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