哺乳动物细胞系在生物药物中的应用：写在CHO细胞系诞生60周年

前言

1957年，美国遗传学家Theodore T. Puck首次分离出CHO细胞，经过60年的发展，CHO成为生物药物应用最为广泛的表达载体。据统计，有超过60%的抗体药物采用了CHO细胞系作为表达载体。

从1982年首个重组蛋白药物胰岛素上市以来，生物药物经历了三十多年的快速发展，尤以抗体药物的发展最为引人注目。生物药物尤其抗体药物的快速发展，催生动物细胞表达平台也发生日新月异的变化。

CHO细胞系的发展

很多蛋白药物包括抗体药物，都需要经过糖基化修饰，这些糖基化常常会影响蛋白药物的有效性、半衰期、免疫原性等。常用的糖蛋白表达载体包括植物细胞、昆虫细胞、转基因动物和哺乳动物细胞等。在所有的这些表达载体中，以CHO细胞系应用最为广泛。

CHO细胞，全称Chinese Hamster Ovary Cell，即中国仓鼠卵巢细胞系。1957年，美国遗传学家Theodore T. Puck从波士顿癌症研究基金会的George Yerganian博士实验室得到一只雌性中国仓鼠，并分离出原始的CHO细胞。从此，CHO在科学研究和医药工业领域逐步获得广泛的应用。

▲Theodore T. Puck（1916-2005）

▲中国仓鼠，来自维基百科

经过60年的发展，CHO细胞系出现了多种成熟的商业化产品，主要包括CHO K1、CHO/dhfr-、CHO-S。CHO K1基于GS体系（谷氨酰胺合成酶），在CHO K1基础上敲除GS基因得到新一代的CHO K1 GS-/-细胞系。龙沙的CHO K1SV即为一代CHO K1细胞系，龙沙的CHO K1SV GS-KO和西格玛-奥德里奇的CHOZN GS-/-即为新一代CHO K1细胞系。CHO/dhfr-为基于DHFR（二氢叶酸还原酶）缺陷型的细胞系，包括赛默飞世尔的CHO DG44和ATCC的CHO/dhfr-细胞系。CHO-S则通过驯化筛选生长速度快的CHO细胞得到，商品化产品为赛默飞世尔的CHO-S。

CHO细胞系的发展谱系如下：

▲CHO细胞系的发展和商业化

龙沙、赛默飞世尔、西格玛-奥德里奇的CHO细胞系如下。

表一主流的商业化CHO细胞系

龙沙的CHO K1SV应用最为广泛，1992年推向市场，已经有29种采用该系统的蛋白药物获批上市，包括罗氏的Zenapax、MedImmune的Synagis和亚力兄的Soliris。龙沙在2012年推出GS的新一代CHO K1细胞系。西格玛-奥德里奇则在2011年推出ZFN技术敲除GS的CHOZN GS-/-细胞系，2015年，百济神州与西格玛达成合作协议，引入CHOZN系统作为其在研抗体药物的表达细胞系。

2011年，科学家解码了CHO-K1的全基因谱系，不同的CHO细胞系基因异质性非常明显。2013年，科学家解码了2只中国仓鼠的基因组和6个CHO细胞系的基因组。

CHO K1表达量高，但需要使用高浓度筛选试剂MSX，导致表达不稳定。CHO-S生长更快，但由于需要使用MTX和嘌呤霉素两种筛选试剂，筛选工作量更大。CHO/dhfr- 筛选更加高效，但生长速度明显低于前两者。2017年，美国阿拉巴马大学的科学家从蛋白组学的层面，比较了CHO K1（赛默飞世尔）、CHO-S（赛默飞世尔）、CHO/dhfr-（ATCC）的表达谱差异。从表达谱水平揭示了三种CHO细胞系生长和外源蛋白表达特性存在差异的可能原因，并为CHO细胞系的基因改造指出了新的线索。

其他表达体系

人细胞系

尽管CHO发展最为成熟，但仍存在一些潜在问题，如CHO不能进行某些人糖基化修饰α-2,6-sialylation和α-1,3/4-fucosylation，同时会进行一些非人源的糖基化修饰，如N-glycolylneuraminicacid (Neu5Gc) （通常低于2%）和galactose-α1,3-galactose (α-gal)（通常低于0.2%）。尽管这些非人源的糖基化修饰比例较低，但仍存在一定的免疫原性风险。

使用人源细胞系是一种直接的解决方法，最常用的人细胞系包括HEK293、HT-1080。2001年获批的Xigris（人activated protein C），是首个获批的人源细胞系表达的唐蛋白药物，但该药物因获益迹象不明显在2011年主动退市。此后的十年内，仅有4款人细胞系表达的药物获批，分别是Agalsidase alfa,Epoetin delta (DYNEPO), Idursulfase (ELAPRASE) 和Velaglucerase alfa (VPRIV)，这4款药物均由HT-1080细胞系表达。2014年，人细胞系表达的蛋白药物明显增多，这一年欧美批准了4个人细胞系表达的蛋白药物，包括百健开发的长效八因子Eloctate、长效九因子Alprolix以及Octapharma开发的八因子产品Nuwiq和礼来长一周一次GLP-1产品Trulicity（度拉鲁肽），四者均采用HEK293细胞系。

八因子有6个硫酸化修饰的位点，对活性至关重要；九因子有12个γ-羧化修饰的位点，对活性至关重要。HEK293表达相对于CHO表达，这两种修饰都更为彻底。

备注：AP,activation peptide，E,γ-羧化修饰的谷氨酸残基，H, β-hyroxylated的天冬氨酸; 0,O-糖基化为点，P, 磷酸化的丝氨酸和苏氨酸，PP, 前肽，S, 硫酸化修饰的酪氨酸; SP, 信号肽，┌┐, 二硫键，▽, 酶切位点， ψ, N-糖基化位点。vWF未显示二硫键，因其含有234个半胱氨酸，绝大多数都形成二硫键。

其他哺乳动物细胞系

BHK（baby hamster kidney cell）细胞常用来表达疫苗产品，上市糖蛋白药物采用BHK表达的仅有3个产品：诺和诺德的七因子NovoSeven、拜耳的八因子Kogenate、百特的猪八因子Obizur。

NS0、Sp2/0在早期抗体药物开发中应用较多，近年来应用明显减少。2015年，有3款抗体药物采用这两种细胞系之一，包括礼来的EGFR抗体药物Portrazza、BMS/艾伯维的SLAM7抗体药物Empliciti、United的GD2抗体Unituxin。2016年，同样有3款抗体药物采用这两种细胞系之一，包括梯瓦的IL-5抗体Cinqair、礼来的PDGF-α抗体Lartruvo、百健/艾伯维的IL-2β抗体Zinbryta，算上Celltrion的英夫利昔单抗类似药Inflectra 则有4款。

植物和昆虫细胞

首个获批的植物来源的蛋白药物是赛诺菲的葡糖脑苷脂酶Elelyso。昆虫细胞来源的获批药物包括：葛兰素史克的宫颈癌疫苗Cervarix、Valeant的前列腺癌治疗疫苗Provenge（已转让给中国三胞集团）和Protein Science的流感疫苗Flublok。

转基因动物

转基因动物来源的药物有3个，包括GTC biotherapeutics开发的抗凝血酶ATryn，来自转基因山羊奶；Salix/Santarus开发的补体C1酯酶抑制剂Ruconest，来自转基因兔奶；亚力兄开发的人溶酶体酸性脂肪酶Kanuma，来自转基因鸡蛋。

小编总结

动物细胞系的发展脚步正日益加速，并逐步深入到细胞系基因改造的层面。一方面，基础免疫学的发展推动抗体药物作用机制的阐明，抗体工程化的改造需求日益增加；另一方面，CRISPR/Cas9等技术的发展，为细胞系的改造提供了更有利的工具；最后，组学研究提供的线索，为细胞系的改造提供了优化空间和路径。

从1905年DBA株系改变了遗传学研究的面貌，1916年小鼠组织相容性的研究开创了免疫学的新时代，小鼠为人类生物学的发展做出了重要贡献。中国仓鼠则通过Theodore T. Puck开创性的工作，CHO细胞系表达了诸多蛋白药物，为人类健康做出了重要贡献。

参考资料

• Industrial production of clotting factors Challenges of expression, and choice of host cells(2015)

• Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells(2017)

• Comparative proteomic analysis of three Chinese hamster ovary (CHO) host cells(2017)

• Genetic analysis of heterogeneous sub-clones in recombinant Chinese hamster ovary cells(2017)

• The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line(2011)

• Lonza、Sigma-Aldrich、Thermo Fisher官网

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