EST｜推进复合污染中的效应导向识别：使用通路连接效应和致毒物质

将不同污染物与复合效应关联是识别复合污染中的毒性物质面临的重大挑战。在本研究中，利用通路将效应与毒性物质联系起来。通过浓度依赖性转录组学评估的通路，将个体效应扩展到涵盖135条通路的分子机制，这些通路对应6个生物过程。由此，通过构建包含2413个化学-通路相互作用的数据库，并识别72条通路的活性碎片，实现了基于机制的毒性物质识别。该方法被应用于两种不同的废水，工业废水OB和市政废水HL。虽然在个体水平上都观察到了致死性和致畸性，但通过通路揭示了不同的分子机制：在OB中显著富集了与心脏毒性和遗传毒性相关的通路，而在HL中则富集了与神经毒性和环境信息处理相关的通路。通过疑似和非靶向筛查，进一步在OB和HL中分别识别出59种和86种致毒物质，其中29种致毒物质得到了确认，它们与90%以上的富集通路相互作用，并贡献了超过50%的个体效应。对致毒物质处理后，观察到毒性物质、通路效应和个体效应的一致性去除。该研究通过通路介导实现了基于机制的识别，支持了复合污染的评估和管理。

效应导向分析（EDA）作为识别复杂环境中致毒物质的有效工具，已经在地表水、饮用水和废水处理中得到成功应用。其关键在于建立污染物与混合效应之间的关系。全生物体体内检测能够评估个体效应，但由于其复杂的毒性机制，直接关联污染物和个体效应较为困难。为了解决这一问题，研究人员开发了一系列结合细胞和全生物体检测的生物检测方法，揭示混合效应的关键毒性机制。然而，由于设备和技术要求较高，其应用受到限制。近年来，组学工具，特别是转录组学，已广泛应用于评估分子机制，并提供了化学与生物通路相互作用的关键信息。生物通路为将化学分析与混合效应联系起来提供了新的视角，并支持了基于机制的致毒物质识别。

尽管如此，识别与通路效应相关的致毒物质仍具有挑战性，因为许多化学与通路的相互作用尚未明确。目前，比较毒理学数据库（CTD）和PubChem等数据库提供了大量有关化学与基因及通路相互作用的信息，这有助于识别致毒物质。但这些数据库覆盖的化学物质有限，无法涵盖众多未知的化学结构。本研究的目标是：（1）开发一种通过通路介导的效应导向识别方法，利用浓度依赖性转录组学将个体效应扩展到分子机制，构建通路致毒物质数据库并识别通路活性碎片，以实现基于机制的致毒物质识别；（2）将所开发的方法应用于不同类型的废水，定量评估综合毒性，揭示关键分子机制，并识别致毒物质，用于指导和优化废水处理。

我们开发了一种基于通路的致毒物质识别框架（图1），包含两个关键步骤：识别关键分子机制和利用化学-通路相互作用基于机制识别致毒物质。首先，从斑马鱼毒理基因组数据中整理了斑马鱼的反应通路，将个体效应扩展到分子效应，进一步将这些效应与浓度依赖的转录组结合，来揭示关键的分子机制。接着，为了实现基于机制的致毒物质识别，一方面，构建了通路-毒物数据库，进行可疑毒物的识别；另一方面，揭示了通路活性碎片，来支持非靶向毒物的识别。

图1 通路介导的效应导向鉴定致毒物的框架

将所开发的框架应用于两种不同类型的废水，包括工业废水OB和市政废水HL。OB进水（OB-in）的致死率显著高于HL进水（HL-in），几乎高出10倍（图2）。同样OB-in的畸形发生率也高于HL-in。总体而言，OB-in和HL-in均观察到了斑马鱼胚胎的致死和致畸现象。仅通过个体效应，无法区分废水的污染类型。

图2 使用斑马鱼胚胎的废水样本的个体效应，包括致死(A)和致畸(B)。

在OB-in和HL-in中分别识别出667个和63个差异表达基因（DEGs），与斑马鱼胚胎的致死结果一致。在OB废水中，RIOK1、PAK4、DHFR、RPL27、TRA2A和RAF1A的扰动最为显著。RIOK1、RPL27和TRA2A参与RNA和前RNA的处理，并与肿瘤生长和侵袭行为相关；PAK4和DHFR对斑马鱼胚胎发育中的心脏发育至关重要；RAF1A调节斑马鱼神经祖细胞的存活。在HL废水中，RFC5、DYNCLL2、ABCB7和ATP5G3B的扰动最为显著，这些基因涉及DNA复制、ATP结合盒（ABC）转运蛋白的调节和线粒体功能障碍（图3A）。

图3 通过斑马鱼胚胎的浓度依赖性转录组分析评估废水样品的通路效应。(A) OB和HL废水中发现的DEGs的浓度依赖性基因网络；(B) KEGG富集通路的效应浓度（EC）累积分布及通路聚类热图；(C)五种生物过程的生物效能分布。

OB-in和HL-in中分别有28条和14条KEGG通路受到干扰（图3B）。与胚胎致死率相似，OB-in表现出更强的生物效力。尽管个体效应相似，但OB-in和HL-in之间的关键分子机制却有很大不同（图3B）。在39条富集通路中，仅有3条途径在OB-in和HL-in之间共享。对于OB-in，心肌收缩是最显著受到干扰的，其次是包括嘧啶代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、代谢途径和同源重组的代谢过程。对于HL-in，最显著受到干扰的通路包括吞噬体、DNA复制、代谢途径、神经活性配体-受体相互作用和MAPK信号通路。总体而言，OB-in和HL-in干扰了五个生物过程，即代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程和生物体系统（图3C）。其中，代谢和遗传信息处理是OB-in中最显著的受扰过程。对于HL-in，遗传信息处理和环境信息处理显著受到干扰，市政废水中也频繁观察到基因毒性。

通过对OB-in中28条富集通路对应的335个可疑物质进行筛选，保留了47个匹配理论m/z和同位素模式的可疑物质（图4A）。此外，在OB-in中识别出4个具有二级识别置信度的通路可疑物质，即4-氯苯胺、咔唑、二氮杂环和咖啡因。对于HL-in，通过对与14条富集通路对应的371个可疑物质进行筛选，保留了54个匹配理论m/z和同位素模式的可疑物质。在这些可疑物质中，进一步识别出12个在HL-in中具有至少两个匹配产物离子的通路可疑物质，达到二级识别置信度。与OB-in中识别的可疑物质不同，这12个可疑物质主要包括药物和个人护理产品以及阻燃剂，匹配市政废水的污染源。这12个可疑物质能够与HL-in中富集的14条通路中的8条相互作用，主要包括代谢途径、抗生素的生物合成和MAPK信号通路。

图4 使用化学-通路相互作用识别致毒物质。(A)可疑致毒物筛查；(B)对致毒物的非靶向筛查；(C)鉴定致毒物氟他胺的实例。

此外，利用通路活性碎片进行了非靶向识别。首先，使用Sirius对非靶向结构进行了计算机注释（图4B）。对于OB-in，在正模式和负模式下，MS-Dial分别提取了10050个和8962个与MSMS谱对应的峰。此外，计算得到了4338个和2273个分子式，并在正模式和负模式下分别注释了5251个和2523个非靶向结构。对于HL-in，MS-Dial分别提取了10037个和9170个与MSMS谱对应的峰。基于此，计算得到了4712个和2254个分子式，并在正模式和负模式下分别注释了6392个和4887个非靶向结构。OB-in中富集的28条通路生成了312个通路活性碎片，而HL-in中富集的14条通路生成了163个通路活性碎片。以氟他胺的识别为例（图4C），模型预测氟他胺的五条最相关的通路分别为Wnt信号通路、VEGF信号通路、代谢通路、MAPK信号通路和神经活性配体-受体相互作用通路。其中，代谢通路、MAPK信号通路和神经活性配体-受体相互作用通路与HL-in中观察到的通路匹配。因此，氟他胺被识别为HL-in中的致毒物质。通过应用化学-通路相互作用模型，分别识别出55个和74个非靶向结构作为OB-in和HL-in中的致毒物质，其中至少有三个预测的前五条通路与废水样品中的富集通路匹配。

在OB-in和HL-in中分别识别出了59和86个致毒物，其中13个和25个被确认至少与CTD中报告的三条路径匹配废水样品中的富集路径。OB-in中的致毒物中，染料中间体如喹啉、3-羟基黄酮、邻苯二甲酸酐、3,4-二氯苯胺和三聚氰胺的浓度较高。与OB-in不同，HL-in中确认了更多的药物、杀真菌剂和驱虫剂。其中，药物如达普酮、可待因、厄贝沙坦、茶碱和抗吡嗪以较高浓度存在，可能与其高日常消费有关。基于CTD数据库提供的化学-通路富集关联，这些毒物能够与OB-in中93%和HL-in中100%的富集通路相互作用。对于OB-in中，每条通路对应1至10个致毒物（图5A）。OB-in中最敏感的五条通路均由这些化学确认的毒物解释。对于HL-in，发现每条通路对应3至23个致毒物（图5A）。HL-in中最敏感的五条通路均由这些化学确认的毒物解释，主要包括双(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯、安非他命、茶碱、氟菌唑和二甲基邻苯二甲酸酯。通过这25种化学确认的毒物，环境信息处理和细胞过程相关的通路受到广泛扰动。

图5 致毒物质的毒理学确认。(A)在OB-in和HL-in中确定的与单个通路对应的致毒物；(B)已证实的毒物对OB-in和HL-in胚胎致死的毒性贡献。

此外，已确认的致毒物能够解释个体效应。对于OB-in，通过毒性平衡分析，这些毒物贡献了58%的胚胎致死率，其中喹啉主导了毒性（高达54%）（图5B）。HL-in中量化的毒物贡献了52%的胚胎致死率，氟虫腈、喹啉和3,4-二氯苯胺主导了毒性（图5B）。HL-in中的主导毒物更加多样，可能与市政废水的多样化污染源有关。

基于识别出的致毒物，对OB-in和HL-in的污水处理进行了升级。对于OB-in，识别出的毒物主要包括难降解的杂环和多环染料或中间体。因此，引入了磁性活性污泥以进行升级，增加了微生物生物量和代谢活性，从而提高了有机污染物和氮的去除效率。升级处理后，观察到致毒物、途径通路和个体效应的一致去除，表明通路效应介导的识别方法有效。更具体地说，在OB-in中，大部分致毒物的去除效率较高，几何平均去除效率为72%（图6A）。然而，贡献最大的毒物喹啉在出水（OB-out）中仍显示出相对高的浓度，这需要针对性去除。与致毒物的高效去除一致，OB-in中富集的28条通路在OB-out中均被100%去除（图6B）。此外，胚胎致死率和畸形等个体效应也得到了高效去除。

图6 污水处理升级后的毒性物质去除(A)和途径效应(B)。

HL-in识别出的致毒物包括各种微污染物，如药物和杀真菌剂，这些物质在常规处理下无法有效去除。因此，引入了通过单个镍原子催化剂（Ni-SAs@CN）激活过氧单硫酸盐（PMS）的芬顿类催化。双重活性位点促进了多种污染物的降解和矿化，且不具选择性。升级处理后，致毒物、通路效应和个体效应均得到了有效去除。HL-in中废水处理的致毒物去除效率低于OB进水，几何平均去除效率为57%。与致毒物的去除一致，HL-in中富集的14条通路中有13条在处理后被100%去除（图6B）。此外，胚胎致死率和畸形等个体效应在处理过程中也得到了有效去除，这表明通过通路效应介导识别的致毒物解释了个体效应。