分子标记技术在獐牙菜属植物研究中的应用进展

分子标记（ molecular markers ）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，直接反映了 DNA 水平的遗传变异和遗传多态性。目前，分子标记技术的发展经历了以限制性内切酶片段长度多态性（ restriction fragment length polymorphism ， RFLP ）、随机扩增多态性 DNA （ random a mplified polymorphic DNA ， RAPD ）和扩增片段 长度 多态性（ amplified fragment length polymorphism ， AFLP ）为主的第 1 代，以简单序列重复（ simplesequence repeat ， SSR ）为主的第 2 代，以单苷酸多态性（ single nucleotide polymorphisms ， SNP ）为主的第 3 代，发展至以多样性芯片技术（ diversity arraystechnology ， DArT ）、靶位区域扩增多态性（ target region amplifiedpolymorphism ， TRAP ）和限制性内切酶位点标签（ restriction-siteassociated DNA ， RAD ）为主的第 4 代分子标记 ^[1] 。较之前常用的形态标记、细胞标记和生化标记，分子标记以独特的分子手段显现出明显优势，被广泛用于农业、药用植物的农作、园艺、生物学、植被保护、中药学、特种医学等各个领域，研究内容涉及遗传育种、遗传多样性、 抗病性、品种鉴定等多个方面 ^[2-5] 。

龙胆科獐牙菜属 Swertia L. 植物全球有 150 种，我国产 79 种，其中青海产 11 种 2 变种，为一年生或多年生草本植物 ^[6] 。该属植物大多有药理作用，如《中国药典》 2015 年版一部中提到的青叶胆全草入药，有清肝利胆、清热利湿功效 ^[7] 。此外，以川西獐牙菜为主的獐牙菜属植物均具有独特的药用价值，被开发成为各种药物用于临床治疗。因獐牙菜属植物和花锚属等相关属植物形态相似，且多具药理作用，被当做“藏茵陈”使用。獐牙菜属具有药理作用的主要物种分布情况及功效见表 1 ^[8-9] 。

查阅近 15 年来的相关文献发现，对獐牙菜属植 物的研究主要集中在其化学成分、药理作用及临床应用方面 ^[10-14] ，分子标记方面研究较少，仅刘黄刚等 ^[15] 研究獐牙菜属植物亲缘关系及资源评价时提到与遗传分子标记学相关的部分内容。自 20 世纪 90 年代初以来，随着市场需求的逐渐增大，獐牙菜属植物被过度滥采，资源遭到严重破坏，现已导致蕴藏量大大减少 ^[16-17] 。因此，用先进的分子标记技 术对獐牙菜属植物进行种质鉴定、遗传多样性等研究，从而在保持物种基原性的基础上加强对獐牙菜属植物的保护迫在眉睫。本文系统阐述了分子标记技术在獐牙菜属植物研究中的应用进展，并从分子角度对獐牙菜属植物的研究做出了进一步的展望。

1 RAPD 技术在獐牙菜属植物研究中的应用

RAPD 技术以 DNA 为模板，以一系列随机短核苷酸片段为引物，进行 PCR 扩增，单一引物与反向重复序列结合，由于引物结合位点 DNA 序列的改变及片段长度、数量的差异，扩增产物经凝胶电泳分离，多态性片段就会被扩增出来。 RAPD 具有多态性丰富、操作简便、灵敏度高、不需预先知道待扩增基因核苷酸顺序、费用较低等优点，可用于研究物种亲缘关系、种质资源遗传多样性、遗传图谱构建、基因定位、资源鉴定等 ^[18] 。

RAPD 技术起步较早，在獐牙菜属植物中的研究主要集中在体细胞杂交、遗传多样性和种质鉴定 3 个方面。体细胞杂交因克服了不同物种间远缘杂交的非亲和性而在植物育种方面逐渐兴起，尤其不对称融合方法的应用实现了目的基因的转移，达到改良物种的目的。獐牙菜属植物种类较多，如川西獐牙菜为高寒地区青藏高原特有种，以专治肝胆疾病而著名，但近年来野生资源逐渐匮乏。为缓解供需压力，体细胞杂交技术在獐牙菜属植物研究中得到应用，通过培养药效成分量较高的体细胞杂交种，对川西獐牙菜等植物进行改良。查阅相关文献发现獐牙菜属植物体细胞杂交方面的研究主要分为形态学、染色体观察和基于分子标记技术的谱带分析。李子东等 ^[19] 和 Wang 等 ^[20] 分别对胡萝卜与川西獐牙菜、狭叶柴胡与川西獐牙菜不对称体细胞杂交种核质基因组特征进行研究。相比于 RAPD 法在体细胞杂交方面的研究，其在药用植物遗传多样性和种质鉴定方面的研究较晚，且多集中在印度等国。 RAPD 技术在獐牙菜属植物研究中的应用情况见表 2 。

2 AFLP 技术在獐牙菜属植物研究中的应用

AFLP 技术是一种高效的 DNA 多态性检测技术，其原理是用 2 种限制性内切酶对基因组总 DNA 进行双酶切，酶切形成的不同大小片段与含有黏性末端的人工接头相连，形成具有不同酶切位点的酶切片段，选用特异性引物对其进行选择性扩增，扩增产物经凝胶电泳分离成不同限制性片段长度多态性的过程。 AFLP 技术具有高效、 DNA 用量少、可靠性好、重复性高、呈典型的孟德尔方式遗传、操作相对简单等优点，被用于遗传图谱构建、遗传多样性检测、种质资源鉴定、目的基因定位、基因表达调控、辅助育种等方面的研究。 AFLP 技术随着不断被改进衍生出了选择性扩增 DNA 片段（ selectiveamplified DNA fragments ， SADF ）等多种相关技术，且各具特色 ^[25-26] 。

目前报道的关于 AFLP 技术在獐牙菜属药用植物中的研究很少，但其具有独特的优势。如 Misra 等 ^[27] 用 AFLP 技术对 6 种獐牙菜属植物进行了 DNA 指纹图谱研究， 64 对 AFLP 引物中的 46 对共产生了 5 312 条条带， 6 种獐牙菜属植物各具特异性条带，如印度獐牙菜产生 131 条，狭叶獐牙菜产生 19 条，普兰獐牙菜产生 47 条，心叶獐牙菜产生 94 条。该研究成功区分了 6 种不同的獐牙菜属植物，为鉴定药材真伪、解决药物掺杂问题提供了一定的实验和理论基础。

3 SSR 技术在獐牙菜属植物研究中的应用

SSR 又叫微卫星，指普遍存在于真核生物整个基因组中的短核苷酸重复序列，是目前应用最广泛的分子标记之一。 SSR 标记具有共显性（以孟德尔方式遗传）、信息量大（等位基因丰富）、信息含量丰富（多态性高）、所需 DNA 量少（仅需微量组织）、实验操作简单、重复性好、位点两侧序列保守性高等特点和优势。 SSR 技术被广泛应用于遗传图谱、基因定位、图位克隆、遗传多样性、遗传变异、品种鉴定、辅助育种等研究 ^[28-29] 。

SSR 分子标记在獐牙菜属中的应用发展相对较慢，直到 2015 年由刘越等 ^[30] 对川西獐牙菜转录组序列进行了 SSR 信息分析，挖掘发现 5 099 条序列中出现了 5 610 个 SSR 位点，发生频率为 7.41% ，其中，出现频率最高的是三核苷酸重复基元，之后是二核苷酸，它们的优势重复基元分别是 AAT/TTA 和 AT/TA ，以 5 ～ 10 次重复为主，主要集中在 12 ～ 30 bp 。以上结果表明在川西獐牙菜转录组中 SSR 较多，重复类型丰富，可用性较高，这为研究獐牙菜 SSR 功能标记提供了丰富的候选序列。此外， Zhang 等 ^[31] 通过 AFLP 法快速分离得到了 24 个 SSR 标记引物，其中， 12 个引物扩增传统藏药植物椭圆叶花锚的 2 个居群时均显示出多态性，预期杂合度为 0.191 ～ 0.784 ，表观杂合度为 0.417 ～ 0.917 ，而这些引物在獐牙菜叶中成功得到了扩增。这为研究椭圆叶花锚的遗传多样性和遗传结构开发了一套新的微卫星标记，同时，也促进了同为龙胆科的獐牙菜属植物遗传方面的研究。

4 ISSR 技术在獐牙菜属植物研究中的应用

ISSR （ inter-simple sequence repeats ），是在 SSR 基础上发展起来的一种新型的分子标记技术，其原理是在真核生物基因组中普遍存在的 SSR 5’ 或 3’ 末端锚定 2 ～ 4 个随机核苷酸作为引物，以 SSR 间具有反向排列的一段序列进行扩增。 ISSR 分子标记技术比 RAPD 、 SSR 多态性丰富，具有简单快捷、易操作、成本低、重复性好、稳定性好、安全性高等优点。 ISSR 技术广泛应用于种质资源的鉴定、遗传多样性、亲缘关系分析、遗传图谱构建以及优质基因的发掘和定位等方面 ^[32-34] 。

ISSR 技术在獐牙菜属中的应用相对比较成熟。 Zhang 等 ^[35] 分别用 RAPD 和 ISSR 法对青藏高原道地植物祁连獐牙菜 3 个居群 63 个个体进行了遗传多样性检测，用 RAPD 法得到 94% （ 156 条）的多态性条带，用 ISSR 法得到 96% （ 222 条）的多态性条带， AMOVA 分析结果表明居群间存在较大分化，用 RAPD 和 ISSR 法检测时居群间分化分别占 52% 和 56% ，认为造成居群间较高遗传分化的主要原因可能是居群间隔离及人类活动对植物生境的影响。从以上研究结果可以看出，用 ISSR 和 RAPD 法分别研究祁连獐牙菜的遗传多样性时，虽然得出结果一致，但数据有一定差别， ISSR 法要优于 RAPD 法。 Tamhankar 等 ^[36] 为鉴别印度獐牙菜及其掺杂物，筛选了 16 对引物，用 ISSR 技术对其中 12 种进行了指纹图谱研究，发现所有引物均能扩增出不同的 DNA 条带，只是不同引物扩增分辨能力不同，条带多态性不同，此结果说明 ISSR 技术可用来鉴别不同的种群，且效率高、结果可靠。杨路存等 ^[37] 采用正交试验与单因素设计相结合的方法，对 PCR 程序中不同条件进行优化筛选，建立了（ 25 μL ） ISSR-PCR 反应的最佳体系： 3.0 mol/L Mg ²⁺ ， 250 μmol/L dNTP ， 0.6 μmol/L 引物， 1 U TaqDNA 聚合酶， 40ng DNA ， 2.5 μL 10 × buffer 。这一体系的建立为 ISSR 法在四数獐牙菜遗传多样性研究及物种保护方面提供了一定基础。在此基础上， Yang 等 ^[38] 又用 10 对引物对四数獐牙菜 34 个居群进行了 ISSR 指纹图谱研究，发现居群间多态位点百分率（ PPB ）为 98.9% ， Shannon 指数（ I ）为 0.347 5 ， Nei 的基因多样性指数（ H _e ）为 0.222 7 ；居群内 PPB 为 32.7% ， I 为 0.177 ， H _e 为 0.12 ，居群间遗传多样性水平较高，而居群内遗传多样性水平较低。这种遗传结构可能是由强大的遗传漂变、繁殖系统和有限的基因流所造成的。四数獐牙菜居群间显著的遗传分化结果表明，为了保护四数獐牙菜的遗传多样性和进化进程，应尽可能地让植株在原生境生长。

5 DNA 条形码技术在獐牙菜属植物研究中的应用

DNA 条形码技术是利用生物体 DNA 中一段保守片段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术。随着分子生物学的快速发展， DNA 条形码技术已成为目前最广泛的植物系统学研究手段。这类特定序列中应用较为频繁的有核基因组 DNA （ nDNA ）中的 ITS 序列，叶绿体基因组 DNA （ cpDNA ）中的 rbcL 、 trnL 和 matK 等序列，线粒体基因组 DNA （ mtDNA ）中的 matK 序列等，已应用于悬钩子、蔷薇等植物的分子系统学研究等方面 ^[39-40] 。本文着重介绍 ITS 和 matK 、 rbcL 、 trnL 序列在獐牙菜属植物中的应用，见表 3 。

从表 3 可看出，从 2001 年至今， DNA 序列在獐牙菜属植物中的研究主要围绕 ITS 展开， ITS 分为 2 部分， 5.8 S 和 2 个内部转录间隔区 ITS1 和 ITS2 。从不同方法的先后使用可以看出人们对 ITS 的研究越来越透彻，主要涉及了种质资源鉴定、遗传多样性研究、系统发育树构建 3 方面内容，此外， 2014 年 Kakiuchi 等 ^[48] 为探究云南 4 种獐牙菜属植物的遗传背景与化学成分是否相关联，分析了 6 种獐牙菜（云南 4 种，河北 2 种） rDNA 序列，即 ITS1 、 5.8 S rRNA 和 ITS2 序列，发现云南 4 种獐牙菜中 2 种遗传背景和化学组成均相似，其余 2 种与河北省 2 种獐牙菜两两比较，发现一对獐牙菜遗传背景相近，化学组成不同，另 1 对獐牙菜遗传背景相似， 化学组成 50% 相似。以上结果说明，尽管遗传背景会对獐牙菜属药用植物成分产生一定的影响，但土壤、气候等环境条件对植株次生代谢产物的生成至关重要。

6 结语与展望

6.1 结语

首先，分子标记技术在獐牙菜属植物研究中的应用主要经历了 RAPD 、 AFLP 、 SSR 、 ISSR 和 DNA 条形码 5 个阶段， RAPD 和 DNA 序列标记技术应用广泛，十分成熟。其中， RAPD 技术应用频繁，主要集中在印度等国。 AFLP 、 SSR 和 ISSR 技术应用相对较少，其中 AFLP 技术应用最少，可能由实验成本过高、操作过于复杂等原因造成； DNA 条形码发展迅速，运用最为广泛。研究者可根据自己的研究条件和研究内容选择合适的分子标记应用于獐牙菜属植物的研究。

其次，从分子标记技术在獐牙菜属植物研究中的领域和内容来说，以研究川西獐牙菜、印度獐牙菜、四数獐牙菜和祁连獐牙菜者居多，研究领域涉及的遗传多样性、系统发育和物种基原、药材鉴别等方面较多，体细胞杂交核基因特征等方面较少。在獐牙菜属中不同分子标记偏向研究不同种类的不同内容，如 RAPD 主要用于研究印度獐牙菜体细胞杂交基因特征、遗传多样性和基原物种鉴定； ISSR 主要用于研究祁连獐牙菜遗传多样性和四数獐牙菜指纹图谱； DNA 条形码主要用于研究川西獐牙菜物种鉴定、四数獐牙菜系统发育和獐牙菜亚族植物系统发育等。

最后，从分子标记技术在獐牙菜属植物研究中的意义来说，研究内容具有不同价值，如研究獐牙菜属植物系统发育能将獐牙菜属中的种更准确地定位到其系统位置，从而更好地了解獐牙菜属某些植物的特征及进化历程；研究獐牙菜属植物遗传多样性，一方面能更好地了解并保护其遗传品质，从而提高其药用化学成分的量，发挥獐牙菜属植物更强大的药用价值，另一方面也能实现对獐牙菜属植物更好的保护；研究獐牙菜属植物基原鉴定能更好地保护其基原，从而实现对其可持续利用。

6.2 展望

本文首次系统综述了分子标记技术在獐牙菜属植物研究中的应用情况，分子标记技术作为一种新型的技术极大地促进了獐牙菜属植物在系统发育等领域的发展，但獐牙菜属植物种类较多，而分子标记技术种类也很多，在獐牙菜属植物研究中的应用还有待加强，应用前景广阔。只有加快遗传多样性、基原鉴定等方面的研究，才能更好的保护和利用獐牙菜属植物。

参考文献（略）

来  源：杨春芳，曾  阳，郭凤霞，王文颖，李锦萍，刘力宽. 分子标记技术在獐牙菜属植物研究中的应用进展 [J]. 中草药, 2017, 48(15):3238-3244.